弓形虫TgROP21基因克隆及生物信息学分析

PCR扩增弓形虫棒状体蛋白21(Tg ROP21)全长基因序列,利用Signa IP和TMHMM在线网站预测分析其信号肽、跨膜区;DNAStar软件分析其亲水性、抗原指数;联合运用Ex PASY和PRODATA在线网站对Tg ROP21的功能域及三级结构进行建模。PCR产物可见1条2 022 bp左右的片段,与预期片段大小相同。成功预测出Tg ROP21的信号肽、跨膜区、亲水性、抗原指数、功能域和三级结构。

弓形虫ROP21基因的原核表达与免疫学鉴定

目的原核表达弓形虫棒状体ROP21基因,并对rROP21蛋白进行免疫学鉴定。方法根据已发表的ROP21基因序列设计引物,通过RT-PCR方法扩增弓形虫RH株的ROP21基因。将ROP21基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)后转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,纯化后进行SDS-PAGE分析、Western blot及IFA分析。结果经PCR和酶切鉴定,成功构建重组表达载体。重组质粒转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,重组蛋白(rROP21)以包涵体形式高效表达,分子质量单位约为45ku。Western blot显示重组rROP21蛋白能被his标签抗体及弓形虫病患者血清识别。用rROP21免疫小鼠,获得滴度为1∶104的抗体血清。IFA显示弓形虫速殖子体内存在ROP21蛋白。结论构建的重组质粒pET28a-ROP21表达的弓形虫rROP21具有抗性,可作为血清学诊断候选抗原,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

弓形虫ROP21诱饵质粒的构建与自激活鉴定

目的筛选与弓形虫ROP21相互作用的宿主蛋白。方法构建弓形虫ROP21基因的三个诱饵载体,通过酵母双杂交技术分别对其在Y2H Gold酵母菌中的毒性和自激活进行鉴定。提取弓形虫RNA并进行反转录,采用RT-PCR方法扩增得到弓形虫ROP21全长序列,根据其不同功能区构建全长或部分序列诱饵质粒,测序后分别命名为pGBKT7-ROP21、pGBKT7-LC和pGBKT7-ST。将重组的诱饵载体转化到Y2H酿酒酵母菌,在营养缺陷型培养基上观察该重组诱饵载体的毒性和自激活现象。结果发现三个质粒转化酵母菌后,pGBKT7-ROP21和pGBKT7-ST存在自激活现象,而pGBKT7-LC转化酵母菌不存在,因此其可以作为酵母双杂交筛选的诱饵质粒。结论为进一步运用酵母双杂交技术筛选与弓形虫ROP21互作的宿主蛋白奠定了基础。