绍兴黄酒麦曲中真菌多样性的研究

运用传统分离培养方法和RISA图谱分析方法,结合序列测定技术对绍兴黄酒麦曲中真菌的多样性进行了研究。通过纯培养的方式对绍兴黄酒麦曲进行分离,并运用ITS序列分析技术对获得的不同菌株进行了分类鉴定,结果显示在分离获得的16种丝状真菌中,伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉是麦曲中的主要真菌。RISA图谱分析结果表明这一非培养方法可应用于麦曲中主要真菌的组成研究。此外,运用RISA图谱技术比较了位于不同区域工厂的麦曲真菌多样性,结果显示不同生产区域的麦曲中优势真菌的组成不同,证实周边地域环境是影响麦曲中真菌多样性的重要因素。

绍兴黄酒成品麦曲中微生物胞外酶的双向电泳技术的建立

应用宏蛋白质组学理论和思想,利用双向电泳技术分离绍兴黄酒成品麦曲中主要包含各种微生物胞外酶的可溶性总蛋白。通过研究不同等电聚焦条件、不同pH值浸提缓冲液以及不同上样量等关键因素对双向电泳结果的影响,建立了适合于绍兴黄酒成品麦曲微生物胞外酶的双向电泳条件,得到了分辨率较高,重复性较好的双向电泳图谱,为进一步通过质谱分析手段全面鉴定麦曲中微生物胞外酶的组成,明确其微生物来源奠定了基础。

绍兴黄酒麦曲中真菌的初步研究

对绍兴黄酒麦曲中的真菌组成和特性、以及制曲过程中的变化进行了初步研究。运用分离培养方法,共获得16种丝状真菌,分子鉴定结果显示,伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉是麦曲中的主要真菌。运用RISA图谱法分析制曲过程中真菌的变化,并结合序列测定技术比较制曲始末的真菌种类,显示出种群结构发生了显著变动。对7株主要丝状真菌的产酶特性进行调查,结果显示,纯培养条件下只有曲霉属的真菌产酶,但在混合培养体系中,产酶种类或数量变化显著。

双菌种制曲改善黄酒麦曲品质的研究

以实验室分离得到的真菌为出发菌株,经平板初筛和制曲复筛,得到用于强化麦曲的功能微生物GC3、ZW12,经分子鉴定分别为米根霉和米曲霉。以糖化酶,α-淀粉酶,酸性蛋白酶为指标,通过不同比例混合接种试验,确定用于制作熟麦曲的菌种为米曲霉苏-16和米曲霉ZW12,混合比例为1∶2。采用响应面分析法对制曲条件进行优化,结果表明:最佳接种量为2.75 mL/50 g原料,原料含水量为81.01%,培养时间47.21h,较传统熟麦曲,3种酶活分别提高了3.5%,77.3%和59.7%。

优势传统黄酒类制造业关键技术与应用系列–2 黄酒麦曲中挥发性香气化合物的研究

研究在国内外首次采用顶空固相微萃取技术和气相色谱闻香法、结合气质联用对中国黄酒麦曲中香气成分进行了定性定量分析,并分别采用气相色谱-嗅闻法中的香气强度法和香气活力值分析了麦曲中有重要贡献的香气物质。研究结果表明:从黄酒麦曲中共分离出了42种挥发性香气化合物,其中香气最强的物质是1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、4-乙烯基愈创木酚,香气较强的物质是苯乙醛、己醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、愈创木酚、香兰素等;香气活力值显示有18种化合物的浓度高于其香气阈值,其中香气活力值大于10的依次是:1-辛烯-3-酮、4-乙烯基愈创木酚、1-辛烯-3-醇、己酸乙酯、己醛、辛酸乙酯、愈创木酚、苯乙醛等,这些化合物的OAV值大,且香气强度也强,因此它们是黄酒麦曲中对麦曲香气有重要贡献的香气化合物。

黄酒麦曲天然发酵中真菌群落的成因初探

对所有可能参与黄酒麦曲发酵的影响因素,包括小麦原料、拌料用水、辅助用具稻草和谷壳,以及发酵车间、压型车间和厂区的空气溶胶中的真菌分布进行了研究,其中的真菌涉及曲霉属、青霉属、犁头霉属、毛霉属、裸胞壳属、毕赤酵母属、红酵母属、锁掷酵母属、镰刀霉属、平脐蠕孢属、尖孢属和链格孢属。结合麦曲发酵过程中真菌的动态变化,发现小麦原料和发酵中所使用的稻草对麦曲发酵过程中出现的真菌影响较大,拌料用水、谷壳和麦曲发酵车间对麦曲堆放成型过程中的影响有限,而压型车间和厂区环境中的空气所含的真菌对麦曲的真菌的形成影响很小。

PCR-DGGE分析绍兴黄酒麦曲中细菌群落方法的建立

利用垂直电泳及时间间歇法初步确立了变性剂的梯度范围和电泳时间,首次建立了聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)法分析绍兴黄酒机制生麦曲和熟麦曲中细菌群落结构的电泳条件。机制生麦曲的变性剂梯度范围为50%～65%,电泳时间为5～5.5h;熟麦曲的变性剂梯度范围为40%～60%,电泳时间为4.5～5h。DGGE条带经切胶回收、重新扩增、T-A克隆及DNA测序后,鉴定结果显示绍兴黄酒麦曲中存在糖多孢菌、肠杆菌、棒形杆菌等多属种细菌,并且从熟麦曲中鉴定到的细菌种类都包含于机制生麦曲中的细菌群落,表明不同工艺的黄酒麦曲其细菌群落结构存在着一定的差异。研究结果丰富了对绍兴黄酒麦曲中细菌群落的认识,为进一步剖析细菌在黄酒发酵中的作用奠定一定的基础。

绍兴黄酒麦曲制曲过程的宏蛋白质组学研究

麦曲在制曲的过程中,以小麦为原料,通过自然接种环境中的微生物,发生一系列的生物化学变化,最终生成黄酒酿造所需的各种粗酶制剂以及风味代谢物质的前体。该研究利用宏蛋白质组学的理论和方法,对绍兴黄酒麦曲制曲过程中6个不同时期(起始期、发酵前期、升温期、高温期、降温期、成熟期)的麦曲浸提液宏蛋白质组进行双向电泳实验,研究麦曲制曲过程中浸提液宏蛋白质组的变化情况。使用PDQuest软件对获得的双向电泳图谱进行比较分析,发现共有12个蛋白点在制曲过程中发生了动态变化。利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF MS)对该12个差异蛋白点进行了质谱分析,其中7个鉴定成功,分别是来自一种稀有细菌的凝结因子5/8型功能蛋白,微单孢菌属的苹果酸脱氢酶,糖红孢红霉菌的葡萄糖-6-磷酸异构酶和羧肽酶前体蛋白,外子藻的功能未知蛋白以及小麦的木聚糖酶抑制剂和几丁质酶。

黄酒机械成型麦曲制曲过程中真菌动态变化的研究

采用传统分离培养和免培养的方法研究了机械化黄酒麦曲堆放成型过程中真菌群落的动态变化情况。研究结果显示,机械化黄酒麦曲堆放成型过程中演替存在的真菌大致分13个属,其中犁头霉属、曲霉属、毛霉属真菌存在于整个麦曲成型堆放过程中。在麦曲成型堆放的前期,麦曲中主要存在犁头霉属(Absidia corymbifera)、曲霉属(Aspergillus oryzae)、毛霉属(Rhizomucor Pusillus)、青霉属(Penicilliumaurantiogriseum)、毕赤酵母属(Pichia burtonii)等真菌。在麦曲成型堆放的中后期,除前期存在的真菌外,还存在裸胞壳属(Emericellanidulans)、散囊菌属(Eurotiumamstelodami)、青霉属(Penicillium chrysogenum)、棒孢酵母属(Clavispora lus-itaniae)、毕赤酵母属(Pichia anomala)、伊萨酵母属(Issatchenkia orientali)、平脐蠕孢属(Bipolaris spicifera)和复膜孢酵母属(Saccharomycopsis fibuligera)。反映出机械化黄酒麦曲在成型堆放过程中真菌多样性丰富,这些真菌微生物在麦曲品质和黄酒大罐酿造中均有重要的影响。

多菌种混合制曲提高麦曲品质

从酒厂环境中分离得到1株适合制曲的细菌,经分子鉴定为解淀粉芽孢杆菌。以糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶为指标,采用均匀设计对制曲条件进行优化,优化后的强化麦曲较传统熟麦曲3种酶活性分别提高了39%、106%、100%,黄酒酿造结果表明:强化麦曲能够加快黄酒酿造速度,提高原料利用率。并且挥发性物质总含量也有所增加,更有助于保持黄酒风味。

北宗黄酒麦曲微生物的分离鉴定

利用梯度稀释法和划线纯化法对麦曲中的微生物进行分离纯化,得到7株细菌和5株真菌。通过形态学特征观察和分子生物学方法进行菌种鉴定,细菌分别为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、根际芽孢杆菌(Bacillus rhizosphaerae)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)。真菌分别为米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、根菌属(Talaromyces radicus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)。

黄酒麦曲中产凝乳酶菌株的分离鉴定

本研究利用梯度稀释法和划线纯化法对黄酒麦曲中的微生物进行初筛,再利用酪蛋白平板法和液态培养基发酵法进行复筛,最终得到了两株产凝乳酶的优良细菌菌株LB-1和LB-2。通过形态学特征观察、生理生化实验以及16S rDNA序列分析鉴定,这两株菌分别确定为甲醇芽孢杆菌(Bacillus methanolicus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。根据凝乳活力曲线发现,这两株菌在发酵24 h时其发酵液的凝乳活力最高,分别为269.66±0.78 SU/m L和187.50±1.4 SU/m L,此时的蛋白水解活力分别为1.476±0.49 U/m L和1.29±1.41 U/m L,凝乳活力与蛋白水解活力比值(C/P)分别为187.50和145.34。通过凝乳效果评价,其发酵液所形成的凝块组织结构、质构参数和风味物质均与商品凝乳酶形成的凝块相当,适用于干酪的加工。

绍兴黄酒麦曲中α-淀粉酶的初步研究

从绍兴黄酒麦曲中分离出产α-淀粉酶的菌株,利用分子鉴定手段,通过序列比对的方式确定其为米曲霉。采用离子交换色谱与凝胶过滤色谱,对绍兴黄酒麦曲中的α-淀粉酶以及利用米曲霉固体培养生产的α-淀粉酶进行了纯化,并对其基本酶学性质进行了研究,其结果基本一致。

南通白蒲黄酒麦曲真菌群落结构研究

黄酒的主要产地是我国的上海、江苏、浙江等地区,南通白蒲黄酒是中国清爽型黄酒的典型代表,与上海和浙派黄酒在口味上具有明显的差异。麦曲作为黄酒发酵的粗酶制剂,是引起黄酒风味差异的主要原因之一。本实验运用传统分离培养方法,并运用ITS序列分析技术分析探讨了南通白蒲黄酒麦曲中的真菌群落结构,并与已报道的绍兴黄酒麦曲微生物群落结构进行了比较。经分离鉴定,南通白蒲黄酒麦曲中的主要丝状真菌为芽枝状枝孢霉、白曲霉、米曲霉、粒状青霉和产黄青霉,其含量分别为24%、25%、6%、18%和22%。与绍兴麦曲中的真菌种群(主要是伞枝犁头霉、米根霉、微小毛霉、米曲霉、烟曲霉和少量青霉)有较大差异。

不同破壁方法提取绍兴黄酒麦曲中的微生物总DNA

分别采用超声波、Yatalase酶法、氯化苄法对黄酒麦曲样品进行破壁,提取微生物总DNA,并通过细胞裂解率、DNA的纯度、片段的分布情况、ITS(内转录间隔区)序列扩增产物的多态性来评估不同的破壁方法对麦曲样品总DNA提取效果的影响。实验结果表明,采用氯化苄法能裂解86%的孢子,OD260/OD280在1.5左右,所得DNA片段分布在100bp～20kbI,TS-PCR扩增出的条带最多,而且简单、经济、提取效果好,可以作为麦曲中微生物总DNA的提取方法。

黄酒麦曲浸提液中宏蛋白质组的制备

麦曲在黄酒酿造中具有重要作用,它能为黄酒酿造提供各种酶类(如水解酶等)及各种风味物质前体。该研究基于宏蛋白质组学理论,分别采用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-D Cleanup Kit试剂盒法提取了黄酒麦曲浸提液中的宏蛋白质组,比较了采用3种不同方法制备样品的双向电泳结果。研究发现,用2-D Cleanup Kit试剂盒制备的样品在溶解性、蛋白纯度和双向电泳分离效果等方面都优于另外2种方法,图谱分辨率高,蛋白点清晰。初步建立了适用于黄酒麦曲浸提液的宏蛋白质组制备方法,获得了较为理想的双向电泳图谱,为后续利用质谱分析手段对宏蛋白质组中的蛋白组成进行全面、准确鉴定奠定了基础。

黄酒熟麦曲混菌制曲工艺研究

为提高熟麦曲中纤维素酶酶活,通过刚果红平板法以及制曲实验,从实验室保藏的麦曲微生物中筛选到1株产纤维素酶较高的真菌CF7,结合菌株形态和ITS基因序列初步鉴定为黑曲霉(Aspergillusniger),并通过响应面法优化其与米曲霉苏-16混合制熟麦曲的工艺。结果表明,培养时间为51h、含水量为62%、接种量为3.9mL/50g小麦时,产CMC酶活达32.5U/g·干曲,是工厂单一菌种熟麦曲产CMC酶活的29.5倍。使用混合熟曲进行小型黄酒酿造,酒精产率提高了6.1%。

浅析绍兴黄酒生麦曲蛋白酶的测定

用紫外分光光度法来测定黄酒生麦曲中手工麦曲与机械化麦曲、不同色泽的手工麦曲之间蛋白酶的含量,同时考虑在滤纸不同其它条件相同的情况下来比较蛋白酶含量的差异。结果表明手工麦曲较机械化麦曲蛋白酶含量高;在手工麦曲中灰白色蛋白酶含量最高,黑色的蛋白酶含量最底。滤纸不同对麦曲的影响不大。

麦芽在黄酒生产中的应用

通过在黄酒发酵过程中以麦芽部分代替麦曲,探索麦芽对黄酒生产的影响。结果表明,麦芽、麦曲最佳质量配比为1∶1,其总量为原料米的10%(w/w),酿出的成品黄酒色泽橙黄、麦香浓郁、口味淡爽、风格独特。试验发现珍珠岩和硅藻土共助滤可有效改善黄酒的沉淀问题,其总用量可控制在2～3 g/L黄酒。结果表明,黄酒发酵过程中,添加麦芽可减少麦曲用量,改善黄酒的品质及风味。

自动化制生麦曲性能的研究

通过生麦曲不同阶段温度和湿度控制条件、发酵和贮存过程理化的变化等研究,引进自动化发酵控制系统,通过连续化和自动控制的集成技术实现了自动化系统制作生麦曲。通过对自动化制生麦曲的糖化力测定,直接投料试验,于传统黄酒生产和机械化黄酒生产及自动化黄酒酿造生产酿制黄酒试验,于自动化控制酿造进行不同后发酵温度和不同后发酵时间酿酒试验研究,结果表明:自动化制的生麦曲质量明显优于对照生麦曲,可减少用曲量10%,直接投料用于生产,酿制而成的酒与对照样不论在理化指标和口味上相同,成品黄酒达到国家标准;自动化制生麦曲应用于自动化酿造黄酒,经口味、生产周期、生产成本等因素综合评价,认为:发酵时间30天左右、后发酵温度14℃左右为佳;自动化制的生麦曲既可应用于传统黄酒酿造,也可应用于机械化、自动化黄酒酿造。