HDAC6 基因敲除的人肝癌细胞系的构建及其生物学功能鉴定

背景肝癌的发病率和死亡率逐年攀升,对肝癌发生发展机制的研究尤为重要。目的应用CRISPR/Cas9技术在人肝癌HepG2细胞中敲除组蛋白去乙酰酶6(histone deacetylase 6,HDAC6)基因,构建HDAC6基因敲除的HepG2稳定表达细胞系,并检测其对人肝癌细胞生长的影响。方法根据CRISPR/Cas9技术靶点设计原则设计特异性识别HDAC6基因的单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)序列,构建LentiCRISPR-HDAC6-sgRNA真核重组表达质粒,测序鉴定后包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选得到敲除HDAC6基因稳定表达的细胞系,Western blot鉴定HDAC6基因的敲除效果,CCK-8生长曲线实验检测HDAC6基因敲除对细胞增殖能力的影响,划痕实验和Transwell迁移实验检测HDAC6基因敲除对细胞迁移能力的影响。Western blot鉴定HDAC6基因敲除对调节α-tubulin乙酰化的影响,细胞存活曲线实验检测HDAC6基因敲除后HepG2对HDAC6抑制剂ACY-1215的敏感度,采用流式细胞术检测HDAC6基因敲除对HepG2细胞周期分布和凋亡的影响。结果成功构建HDAC6基因敲除的HepG2稳定表达细胞系后,经实验证明HDAC6基因敲除能够显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移,使α-tubulin的乙酰化表达增强且能降低HepG2对ACY-1215的敏感度,还能使HepG2细胞发生G1期阻滞,促进HepG2细胞的凋亡。结论敲除HDAC6基因可以抑制HepG2细胞增殖和迁移,使α-tubulin乙酰化程度增加,调节HepG2细胞对ACY-1215的敏感度,且影响HepG2细胞的周期和凋亡,为进一步研究HDAC6在肝癌中的功能机制奠定了基础。

HDAC6抑制剂的特性及应用

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)可调节与细胞生长、转移、凋亡相关的多种细胞途径。HDACs抑制剂可以影响多种细胞效应,诱导细胞凋亡,阻碍细胞循环,抑制血管生成,其作为一种抗肿瘤制剂被广泛研究。研究证实,HDAC6抑制剂在治疗阿尔茨海默病、脑胶质瘤及神经保护方面的作用也受到越来越多研究者的关注。目前研究的HDAC6抑制剂极为有限,主要包括ACY-1215、Tubacin、Tubastatin A等。本文对几种常见的HDAC6抑制剂的特性及其临床应用进行综述,阐述该类药物在抗肿瘤、神经保护及其他方面的应用现状。

选择性HDAC6抑制剂ricolinostat的合成新方法

设计了一条新路线合成选择性组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)抑制剂ricolinostat(ACY-1215,1)。以2,5-二氯嘧啶(2)为起始原料,与二苯胺反应得5-氯-N,N-二苯基嘧啶-2-胺(3),与氰化锌发生偶联反应得2-二苯胺基嘧啶-5-甲腈(4),在硫酸溶液中水解得2-二苯胺基嘧啶-5-羧酸(5),与7-氨基庚酸甲酯缩合后,再与盐酸羟胺在氢氧化钠作用下氨解得目标化合物1,总收率19.8%(以2计)。本路线中化合物3和4为未见文献报道的新化合物。