四种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞(Bm-e-HNU5)内的瞬时表达

以红色荧光蛋白基因(RFP)为报告基因,构建含4种不同启动子的重组表达质粒,用脂质体介导法转染家蚕Bombyxmori细胞(Bm-e-HNU5),观察家蚕细胞质肌动蛋白4基因启动子(A4)、α微管蛋白基因启动子(α-tub)、蚕丝心蛋白重链基因启动子(Fib)和家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子(IE)4种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达情况。构建的重组表达质粒pDsRed-α-tub、pDsRed-A4、pDsRed-IE和pDsRed-Fib经双酶切和PCR鉴定正确无误。转染和转录实验结果表明,除了pDsRed-A4外,其他3种重组质粒在Bm-e-HNU5细胞中都得到高转染率,α-tub、IE和Fib可依次增强RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达活性。

地铁车站工程应用双向RFPS支座隔震效果研究

基于阪神地震中地铁大开站的震害机制，借鉴地面隔震建筑的研究成果，提出了地下结构中柱柱顶设置辊轴摩擦摆（RFPS）隔震支座的设计理念，根据拉格朗日方程推求了该隔震系统的运动方程，并运用Newmark-β时域逐步积分法对其求解。研究结果表明：尝试在地铁地下结构抗震设计中，采用隔震设计的理念在理论上是可行的；RFPS隔震支座具有良好的耗能和自复位特性，较长的自振周期使其具有必要的震动隔离能力；地铁车站中柱柱顶设置RFPS支座后，可以大幅度减少结构（尤其是中柱）的内力和变形，且无需担心隔震部位会出现大变形；适当选取圆弧滑道半径和滚动摩擦系数值，隔震效率可达到50％～70％。

局部植入利福平(RFP)缓释剂对P糖蛋白(P-gp)活性及激素性股骨头坏死的影响

目的观察局部植入利福平(rifampicin,RFP)缓释剂对P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)活性及激素性股骨头坏死的影响。方法建立激素性股骨头坏死的动物模型,取32只成年雌性兔,随机平均分为4组:3个对照组(空白/口服给药/肌肉注射)和局部缓释组(试验组)。其中局部缓释组于左侧股骨上段植入RFP缓释剂,右侧相同位置植入空白颗粒作为对照。4周后检测外周血、骨髓内单核细胞P-gp活性,肝内细胞色素P450(cytochrom P450,CYP450)含量,比较骨代谢血清学指标、组织学形态(HE、Masson染色)、股骨头坏死率。结果局部缓释组左侧骨髓内P-gp活性高于右侧(P<0.05)。口服、肌注组外周血P-gp活性和肝细胞色素P4503A含量高于局部缓释组(P<0.05)。HE染色示:局部缓释组左侧股骨头比右侧骨小梁增宽,脂肪细胞减少,骨坏死率降低(P<0.05);口服、肌注组股骨头骨质流失及脂肪化受到抑制。Massons染色示:口服、肌注及局部缓释组左侧股骨头骨质成熟胶原较多,矿化完全。结论局部植入RFP对外周P-gp及肝内CYP450无明显影响,可增强骨内P-gp活性,降低激素性骨坏死发生率。

黄瓜棒孢叶斑病病原菌RFP标记转化株的构建

由多主棒孢(Corynespora cassiicola)侵染引起的黄瓜棒孢叶斑病已成为我国黄瓜生产上的重要新流行病害,目前尚缺乏抗性品种,病原菌侵染机制及与寄主的互作关系尚不清楚。为了开展多主棒孢的病原学研究,本试验采用农杆菌基因介导技术(ATMT),获得了红色荧光蛋白(RFP)标记的多主棒孢转化株,转化株在PDA培养基转接6次后仍能在菌丝和分生孢子上发出强烈的红色荧光,生物学测定和致病性测定结果表明该转化株与野生型菌株无显著差异。

GFP和RFP报道基因在人体不同细胞中转导率的比较研究

目的比较慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)报道基因在人体不同细胞中的转导率,为再生医学和组织工程学研究中报道基因的选择提供依据。方法将构建的GFP和RFP慢病毒载体分别转染人骨髓间充质干细胞(hMSC)、人脐静脉内皮细胞株(Eahy926)和人肺泡上皮细胞株(A549)。4d后,用流式细胞仪检测GFP和RFP的转导率,并利用激光共聚焦显微镜观察GFP和RFP的表达特征。结果 GFP和RFP在hMSC、Eahy926和A549三种细胞间的转导率均有显著性差异(P(0.01);在hMSC或Eahy926或A549的同种细胞中GFP和RFP的转导率也有显著性差异(P(0.01);RFP在部分Eahy926和A549细胞局部高表达。结论慢病毒载体介导的GFP和RFP报道基因在人体不同细胞中的转导率明显不同。

BALB/c小鼠I-A^dαβ链RFP融合双顺反子表达载体的构建及其在COS-7中的表达

构建了在β链C端融合红色荧光蛋白(RFP)标签的BALB/c小鼠I-Adαβ链真核双顺反子表达载体pRed-IRES-I-Ad,使用LipofectAMINE2000转染COS-7细胞,用激光共聚焦显微镜观察外源蛋白在细胞中的表达与定位。I-Adαβ分子在COS-7细胞中能够以较高的效率表达,并且在COS细胞中能形成聚集状态。与通常的真核翻译帽子结构起始相比,IRES启动真核翻译系统的效率低于前者;与空质粒对比,IRES介导的真核翻译起始,RFP的表达量较低。

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性。方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性。结论成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础。

PACS实施中的RFP模板及其应用

通过结合国内医疗体系的现状和借鉴国际上成熟的PACS实施经验,构建了一个RFP模板。该模板从技术、运作和商务三个方面对PACS实施中的需求进行了讨论,从项目概况、系统组成、系统集成等方面对RFP的主要内容进行了分析,并基于QFD技术形成了层次化结构的UR树。该模板经浙江大学医学院附属第一医院在全院PACS系统的实施中应用,表明,是可行的和有效的。

p53RFP表达载体的构建及其对HEK293A细胞增殖的抑制作用

目的构建p53RFP表达载体,观察p53RFP表达上调对HEK293A细胞生长的影响。方法利用DNA克隆技术,将人p 53RFP基因的编码序列克隆至质粒pcDNA4/Myc-HisA,经限制性酶切、DNA测序鉴定重组载体。质粒扩增提取,经脂质体介导法转染HEK293A细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测转染后p53RFP mRNA及蛋白的表达水平。采用CCK-8检测p53RFP表达上调对HEK293A细胞增殖的影响。结果 p 53RFP转染后其mRNA及蛋白表达水平均显著上调;p 53RFP转染后72 h、96 h,细胞增殖受到显著抑制(P<0.01)。结论成功构建p53RFP表达载体pcDNA4-p53RFP,并可在HEK293A细胞内有效表达,其表达可抑制HEK293A细胞增殖。

利用RFP标记进行水稻籼粳杂种偏分离的遗传分析

为了研究水稻籼粳杂种偏分离的遗传基础,用转化红色荧光蛋白(RFP)的7个粳稻株系与籼稻杂交,以整合在不同基因组位点的RFP为可视遗传标记,对F1花粉及F2植株进行遗传分析。根据‘7F5’转基因系的研究结果,在粳稻‘日本晴’和籼稻‘9311’杂交的遗传背景中,水稻基因组chr02:33465170位置附近存在一个花粉偏分离位点。‘9A2’转基因系组配的籼粳杂种产生1∶1(RFP+∶RFP-)比例的花粉,并且其F2植株群体发生偏分离,说明相应RFP位点(chr04:29587748)附近有一个控制F2植株偏分离的连锁位点,该位点的遗传机制与F1的花粉比例无关。RFP标记提高了籼粳杂种花粉及后代植株的研究效率,为探索偏分离遗传机理提供了新的研究手段。

用无终止子的RFP报告基因捕获水稻终止子研究

基因捕获技术已被广泛应用于植物功能基因组学研究。文章构建了水稻PolyA捕获载体pLJ19,该载体含有用于检测转化事件的绿色荧光蛋白报告基因(GFP)及用于进行PolyA捕获的无终止子的红色荧光蛋白报告基因(RFP),在水稻转化愈伤组织阶段筛选同时含有GFP及RFP的转化愈伤组织并进行RFP插入位点T-DNA侧翼序列(FST)分析可获得水稻终止子序列。将pLJ19转化粳稻品种‘日本晴’的胚性愈伤组织,获得了17个具有PolyA捕获事件的愈伤组织。FST序列分析表明6个T-DNA插入在水稻基因组序列中,其中有5个T-DNA插入在水稻基因3’端附近。结果表明,pLJ19载体可用于水稻终止子捕获研究中,可为水稻终止子研究提供研究方法和材料。

基于Tet-on系统的RFP基因表达载体构建及功能验证

【目的】构建四环素诱导表达调控系统的表达载体,并对其功能进行验证。【方法】利用pTRE-tight和pdsred-Express2-N1构建带有红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)基因的载体pTRE-DSred,用其与另一载体pTet-on共转染293T细胞,并加入不同质量浓度(0,0.1,1,10μg/mL)的强力霉素(doxycycline,DOX)诱导,以未经质粒转染的293T细胞为对照组,在荧光显微镜下观察RFP基因的表达情况。【结果】成功构建了pTRE-DSred重组质粒,将其与pTet-on质粒共转染293T细胞,在细胞培养液中分别添加0.1,1,10μg/mL DOX,48h后均有红色荧光蛋白的表达,但10μg/mL DOX组红色荧光蛋白的表达水平明显低于前2个组;0μg/mL DOX诱导组中也有红色荧光蛋白表达,但水平极低;在未转染质粒对照组中未观察到红色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,pTREDsred和pTet-on共转染组均检测到RFP基因的转录。【结论】成功构建了Tet-on系统RFP基因表达载体,适宜质量浓度的DOX诱导有助于目的基因的高水平表达,但在不添加DOX诱导剂时,该Tet-on系统存在目的基因低渗漏表达现象。

p53RFP对SW480细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

目的:观察p53RFP过表达对SW480细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法:利用脂质体介导法将p53RFP表达载体转染SW480细胞,Western blot检测p53RFP蛋白表达水平,实时定量RT-PCR检测细胞周期相关蛋白mRNA表达。采用CCK-8检测p53RFP表达上调对SW480细胞增殖的影响、PI染色流式细胞术进行细胞周期分析、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果:p53RFP转染后48 h、72 h、96 h细胞增殖受到显著抑制(P<0.001),p53RFP转染后48 h细胞G2期细胞含量显著高于空载转染组(P<0.05),细胞凋亡率亦显著高于空载对照组(P<0.05)。p53RFP过表达可诱导p21 WAF1/CIP1mRNA表达增加(P<0.05),对CyclinB1、CyclinD1、CDK1 mRNA表达无显著影响。结论:p53RFP过表达可抑制SW480细胞增殖、介导G2期阻滞、诱导细胞凋亡。

RFP_（134）对UMR106细胞EGF受体酪氨酸蛋白激酶的调节作用

以大鼠成骨肉瘤细胞（ＵＭＲ１０６）为模型，研究了表皮生长因子（ＥＧＦ）对其受体酪氨酸蛋白激酶（ＴＰＫ）的调节作用。以本实验室从植物中提取纯化的二萜类活性物质（ＲＦＰ１３４）为诱导分化剂，观察了ＲＦＰ１３４对ＵＭＲ１０６细胞ＥＧＦ受体ＴＰＫ的活性和磷酸化作用的影响，并与ＲＡ和ＲＦＰ１３４＋ＲＡ处理细胞做了比较，结果显示ＥＧＦ与其受体结合后能激活ＴＰＫ，使ＴＰＫ活性增加２倍．ＲＦＰ１３４，ＲＡ，ＲＦＰ１３４＋ＲＡ处理细胞后，分别降低ＥＧＦ诱导的受体ＴＰＫ活性５０％，４３％，５５％，降低磷酸化ＴＰＫ含量５５％，３６％，５３％。从结果中发现无ＥＧＦ刺激的细胞也具有受体ＴＰＫ磷酸化作用，用ＲＦＰ１３４，ＲＡ，ＲＦＰ１３４＋ＲＡ处理细胞，分别降低受体磷酸化ＴＰＫ含量５９％，４０％，５７％，而且我们发现用ＥＧＦ诱导的细胞受体ＴＰＫ含量高于无ＥＧＦ作用的细胞．提示ＵＭＲ１０６细胞本身可能具有受体ＴＰＫ活性，能够引起细胞受体自动磷酸化，ＥＧＦ刺激后ＴＰＫ的磷酸化作用增强，可见ＲＦＰ１３４对ＥＧＦ诱导的ＴＰＫ磷酸化和无ＥＧＦ诱导的受体自动磷酸化都具有明显的抑制作用，（并强于ＲＡ）这可能与在第二信使水平上阻抑ＰＴＰＫ活性密切相关?

SWIP-RFP装置慢斜升放电的反场箍缩实验

在硅化后的良好器壁条件下，采用慢斜升放电模式，获得了具有高电流密度和较高温度的反场箍缩（ＲＦＰ）等离子体。在实验中观测到环向磁通长时间持续增长，随等离子体电流增大而增大，并出现与环向磁通相伴随的ＭＨＤ扰动现象。实验证实，斜升放电的ＲＦＰ等离子体存在“发电机”（ｄｙ－ｎａｍｏ）效应。ＲＦＰ位形维持时间长达８００μｓ，等离子体电流约１００ｋＡ，电子和离子温度分别达到７０ｅＶ和８５ｅＶ。

人、鼠正常组织及人食管鳞状细胞癌组织中RFP蛋白的表达检测

目的:研究RFP(Ret Finger Protein,RFP)在人、鼠正常组织及食管鳞状细胞癌组织中的分布。方法:本研究运用 实时定量PCR方法并以18SrRNA作为内对照分析了RFP在人子宫颈、子宫内膜、睾丸、胃、食管和脑组织以及在鼠肺、肾、子 宫、卵巢、胸腺、心、肌肉、睾丸、皮肤、食管、脾、肝和肠等正常组织和人食管鳞状细胞癌组织中的表达。结果:RFP蛋白只在人 和鼠的睾丸组织中高表达,而在其他正常组织中低表达,在20例人食管鳞状细胞癌组织标本中检测到13例RFP表达上调, 其中9例有显著意义(P<0.05)。结论:由于RFP蛋白在正常组织中只高表达于睾丸组织,而约65％人食管鳞状细胞癌组织 中该蛋白的表达上调。上述结果提示RFP蛋白可能是治疗人食管鳞状细胞癌的一个潜在的分子靶点。

RFP转基因小鼠模型的建立

为了建立组织广泛表达红色荧光蛋白(red fluorescence protein,RFP)的转基因小鼠,为肿瘤和干细胞等研究提供动物模型,试验从pdsred-express2-n1载体上酶切后获得线性化的CMV-Dsred基因片段,将CMV-Dsred基因注入ICR小鼠受精卵雄原核内,获得的仔鼠利用活体荧光蛋白观察系统、PCR和Southern-blot的方法进行分子水平的检测,同时用后代小鼠的组织制作冰冻切片在荧光显微镜下观察。结果表明:荧光蛋白活体成像系统检测到组织广泛表达红色荧光蛋白的小鼠,阳性小鼠基因组中均检测到Dsred基因的整合,在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠道、子宫、肌肉、脂肪和皮肤等组织器官中均检测到红色荧光蛋白。说明成功获得了组织广泛表达红色荧光蛋白转基因小鼠模型。

SWIP-RFP装置反场箍缩位形研究

SWIP-RFP装置是具有金属真空室的环形反场箍缩(RFP)装置.在初始气压,初始环场,可控辅助反场和等离子体自反效应的不同情况下,做了反场建立条件的实验。在有自反效应和可控辅助反场时间配合的三种运行情况下,反场箍缩放电已实现.本文给出了反场箍缩位形实验观测的结果,实验测出反场箍缩位形的等离子体电流幅值。脉冲长度与相关因素的依赖关系.实验结果表明在无功率短路情况下,等离子体存在时间τ_p≥0.3ms。

结核分枝杆菌耐RFP快速检测的方法研究

目的应用PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药性的意义。方法采用PCR-SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌rpoB基因突变。结果50例耐RFP菌株中有45例PCR-SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别,与药敏试验结果做对比,PCR-SSCP检测敏感性为90%,特异性为100%;12例敏感菌株与H37Rv条带一致,35份肺结核病人痰标本,21份痰PCR扩增阳性,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别,而且PCR-SSCP28份图谱与H37Rv有差别,阳性率为80%。结论PCR-SSCP检测结核分枝杆菌rpoB基因突变快速、简便、易行,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法。

实时荧光定量PCR方法检测人癌组织中RFP蛋白的表达

目的检测RFP(Ret finger protein)蛋白在人正常组织及人癌组织中的分布。方法采用实时荧光定量PCR方法,以18 S rRNA为内对照,检测RFP在人正常组织及人癌组织中的表达水平。结果RFP表达水平子宫颈鳞状细胞癌组织高于正常子宫颈组织,子宫内膜腺癌组织高于正常子宫内膜组织,胃腺癌组织高于正常胃组织,食管鳞状细胞癌组织高于正常食管组织,而子宫内膜腺癌组织高于子宫颈鳞状细胞癌组织,胃腺癌组织高于食管鳞状细胞癌组织,脑癌组织高于正常脑组织。结论RFP可能成为治疗恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。