核糖体工程技术选育卡伍尔链霉菌高产菌株

通过赋予前期分离获得的一株卡伍尔链霉菌菌株TJ430利福平抗性,达到迅速提高菌株产抗生素能力的目的;采用核糖体工程技术使菌株TJ430的ropB基因发生突变从而获得利福平抗性,通过构建好的高通量筛选模型结合高效液相色谱技术,筛选正向和负向突变菌株,利用液体发酵复筛进一步确认初筛结果,通过对突变株进行基因测序寻找突变株ropB基因的突变位点;构建的高通量筛选模型能准确、快速筛选出突变菌株,分离到5株正向突变株和2株负向突变株。在负向突变株ropB基因的第280 bp处发现一个点突变,但是在正向突变株测序片段中未发现突变位点。采用的引物序列只能对ropB基因的部分序列进行测序,从正向突变菌株抗生素产量较原始菌株提高2.5倍以上,且菌丝形态发生显著变化来推测,正向突变菌株的突变位点应位于ropB基因中未测序片段。在完成原始菌株全基因组测序基础上,可重新设计引物对该菌株的全ropB基因进行测序,寻找突变位点。

PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变,同时对片段长度为215 bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以及35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR-SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到rpoB碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中,PCR-SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱,PCR-SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88.6%(31/35)和100%(23/23)。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析,在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91.4%(32/35)和100%(23/23)。卡方检验,PCR-SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异(P>0.05)。若以DNA测序为标准,则PCR-SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93.1%(54/58),96.9%(31/32)和100%(23/23)。结论PCR-SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。