Subzonal fertilization of mouse round spermatids

Mouse round spermatids were electrofused with homologous mature oocytes to examine the be-haviour of their nuclei within the ooplasm and the abilities of development. A single spermatid was injected in the perivitelline space of a mature oocyte and an electron fusion pulse was given. The best round spermatid-oocyte pairs (RS-O) fusion took place at 20-30 s AC (1 MHz, 50V/cm) followed by a single fusion DC pulse (3 700-3 800 V/cm, 25 μs) and another 30 s AC current. The total survival rate and fusion rate of RS-O were 89.0% (575/646) and 61. 9% (356/575), respectively. 49.2% (175/356) of fused oocytes developed to 2PN stage . The concentration of Ca2+ in the fusion medium produced no significant effect on the above targets. The 2PN development rate of the fused RS-O from the oocytes collected 14-16 h after hCG injection was higher than others. 32.6% (57/175) of the 2PN oocytes had fully developed spermatid (male) and oocyte (female) pronuclei. The rest spermatid-derived pronu-clei remained small in

圆头精子注射临床疗效的Meta分析

目的探讨圆头精子注射(ROSI)应用于圆头精子症患者的临床疗效。方法检索Medline、Embase、Cochrane Library以及ClinicalTrials.gov数据库,纳入从建库至2022年10月关于圆头精子症患者应用ROSI治疗的研究,采用荟萃分析与亚组分析评估ROSI的临床疗效。结果共纳入29项研究,共计1363例患者进行分析。ROSI后的总受精率(2PN)为37.9%(95%CI:30.7%~45.4%),总妊娠率为3.8%(95%CI:0.8%~8.1%),最终分娩率为1.8%(95%CI:0%~5.6%)。改进圆头精子的鉴别方法之后,ROSI后的妊娠率(21.2%)和分娩率(13.1%)有所提高;亚洲地区的受精率(41.5%)高于非亚洲地区(33.4%),但其妊娠率和分娩率(2.8%、0.9%)低于非亚洲地区(6.4%、5.9%)。结论ROSI对圆头精子症患者的生育具有积极意义,不同地区间ROSI治疗结局有差异。改善圆头精子的鉴别方法之后,ROSI的临床疗效得到提高。

近日节律基因Clock对雄性小鼠生殖功能的影响

目的通过干扰小鼠睾丸节律基因Clock的表达,研究Clock对雄性小鼠生殖能力的影响。方法通过RNA干扰技术干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达,以Western blot检测干扰效果,研究干扰Clock表达后对小鼠体内胎仔数和精子数量、精子活力、体外受精率的影响。结果Clock干扰质粒使小鼠睾丸Clock蛋白的表达明显下调。在体内实验不但影响了雄性小鼠的胎仔数,而且其相对应的精子体外受精能力也明显下降。结论节律基因Clock与雄性小鼠的生殖功能有密切的关系。

小鼠精子和球形精子细胞显微注射受精研究

目的研究动物受精机理。方法以昆明白鼠为实验动物，利用显微注射技术，对精子和球形精子细胞的显微注射受精进行了研究。结果１．带下注射受精，注射４～６个精子的卵的受精率（３２．５％）和卵裂率（２５．０％）显著高于注射单个精子的卵的受精率和卵裂率（分别为１２．５％和６．３％）（Ｐ＜０．０５）。２．带下注射４～６精子后，有第１极体卵母细胞的存活率（６９．６％）、受精率（３２．５％）和卵裂率（２５．０％）分别高于无第１极体卵母细胞的存活率、受精率和卵裂率（分别为６４．４％、２０．７％和１３．８％），但两者无显著差异（Ｐ＞０．０５）。３．胞质内精子注射卵的存活率（２１．４％）极显著低于带下注射卵的存活率（６９．６％）（Ｐ＜０．０１）；而胞质内精子注射卵的受精率（３５．５％）、卵裂率（３２．３）％和囊胚率（２０．０％）则高于带下注射卵的受精率（３３．３％）、卵裂率（２５．０％）和囊胚率（１０．０％），但无显著差异（Ｐ＞０．０５）。４．将球形精子细胞注入经电活化处理的卵母细胞的透明带下，注射卵的存活率为９０．５％，电融合率为３４．６％，２－细胞分裂率为２８．３％。结论１．注射精子的数量对小鼠带下注射的受精率和卵裂率有显著影响?

化学激活在小鼠圆形精子细胞体外受精中的应用

目的:通过对生精细胞体外培养所获圆形精子细胞显微注射(ROSI)后的小鼠卵母细胞进行单一和联合化学激活,寻找小鼠圆形精子细胞体外受精的最佳激活方案。方法:采用不同浓度的乙醇(EH)、离子霉素(Ion)、钙离子载体A23187(CIA)、氯化锶(SrCl2)、6-二甲基苯胺嘌呤(6-DMAP)及放线菌酮(CHX)对ROSI后的卵母细胞进行不同作用时间的激活,并根据不同的激活途径,联合两种最佳激活浓度和时间的激活剂对ROSI后的卵母细胞行联合激活,以受精率、卵裂率和桑囊胚形成率为观察指标,比较单一及联合方案对卵母细胞的激活效果。结果:①单一激活时,各激活剂的最佳方案分别为7%EH作用6 min,5μmol/L CIA作用5 min,5μmol/L Ion作用5 min,2 mmol/L 6-DMAP作用2 h,10 mmol/L SrCl2作用1.5 h,10μg/ml CHX作用1.5 h,其中10 mmol/L SrCl2作用1.5 h桑囊胚率最高,显著优于CHX方案(P<0.05),但与其它各组无显著性差异;②EH+6-DMAP组桑囊胚率(29.63%)显著高于其它联合激活组以及除SrCl2以外所有单一激活方案(P<0.05),且正常受精率、卵裂率及桑囊胚率均高于SrCl2组,但无显著性差异。结论:单一激活方案中10 mmol/L SrCl2作用1.5 h,联合方案中7%EH作用6 min+2 mmol/L 6-DMAP作用2 h对体外培养所获圆形精子细胞ROSI后的卵母细胞激活效果最佳。EH+6-DMAP的联合激活方案优于单一激活。

节律基因Clock对雄性小鼠顶体酶活性的影响

目的通过干扰小鼠睾丸节律基因Clock的表达,研究C ock对雄性小鼠顶体酶活性的影响。方法通过RNAi干扰技术干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达。以Western Blot检测干扰效果。研究干扰Clock表达后对小鼠顶体的形态发育和顶体酶活性的影响。结果CLOCK干扰质粒使小鼠睾丸CLOCK蛋白的表达明显下调,顶体酶活性明显下降。结论节律基因Clock可能通过调节顶体酶活性来影响雄性小鼠的生殖功能。

不同融合参数对小鼠圆形精子细胞与卵母细胞融合胚胎发育的影响

目的利用手工克隆(handmade cloning,HMC)技术对小鼠圆形精子细胞与去透明带卵母细胞进行电融合,以研究电融合参数对融合胚胎发育潜能的影响。方法选取549枚卵母细胞与圆形精子细胞融合,根据电融合参数分为三组:A组(n=186)采用电场强度60V/mm、脉宽30μs、脉冲次数为2次的直流电脉冲;B组(n=188)采用电场强度80V/mm、脉宽20μs、脉冲次数为2次的直流电脉冲;C组(n=175)采用电场强度100V/mm、脉宽10μs、脉冲次数为2次的直流电脉冲。观察记录不同电融合参数下圆形精子细胞与无透明带卵母细胞的融合率、融合胚胎卵裂率以及囊胚形成率。结果(1)A组圆形精子细胞与去透明带卵母细胞的平均融合率为(84.87±3.84)%,与其他两组[(74.93±5.46)%、(73.60±5.48)%]相比平均融合率显著升高(P<0.05);(2)A组融合胚胎的平均卵裂率为(77.37±3.97)%,与B组、C组融合胚胎的卵裂率[(67.74±7.32)%、(66.17±9.87)%]相比显著升高(P<0.05);(3)A组的平均囊胚形成率为(41.28±6.50)%,显著高于C组[(31.03±6.09)%](P<0.05)。结论 A组采用电场强度60V/mm、脉宽30μs、脉冲次数为2的直流电脉冲是圆形精子细胞与去透明带卵母细胞融合的最佳方案,有利于提高胚胎的发育潜能。

节律基因Clock干扰对小鼠精子受精能力的影响

目的通过干扰小鼠睾丸圆形精子期节律基因Clock的表达,研究Clock对雄性小鼠精子受精能力的影响。方法小鼠睾丸注射Clock干扰质粒,Western Blotting检测注射后睾丸组织Clock表达的变化,体内实验观察注射干扰质粒前后引起雌鼠胎仔数变化,体外实验观察精子数量、精子活力、体外受精率以及对顶体发育的影响。结果Clock干扰质粒使小鼠睾丸CLOCK蛋白的表达明显下调。体内实验结果显示注射Clock干扰质粒影响了雄性鼠致雌鼠的胎仔数,体外实验结果显示,虽然注射Clock干扰质粒后精子计数、精子活力无明显变化,但体外受精能力明显下降。顶体酶活性明显下降。结论节律基因Clock与雄性小鼠的生殖功能有密切的关系。节律基因Clock可能通过调节顶体酶活性来影响雄性小鼠精子的受精能力。

冻融小鼠圆形精子细胞在体外受精中的应用研究

目的:探讨冻融小鼠圆形精子细胞在体外受精中的应用价值。方法:体外培养获得的小鼠单倍体精子细胞冻融复苏后,经4',6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料标记后,行小鼠卵胞质内圆形精子细胞显微注射(ROSI)(冻融组,n=259),同时以体外培养获得的新鲜单倍体精子细胞行ROSI(新鲜组,n=238)作对照,比较两组精子细胞受精能力和后续胚胎发育能力。结果:体外培养获得的小鼠单倍体精子细胞冻融后存活率为(75.9±2.3)%。冻融组与新鲜组受精率(51.9%vs 55.7%)、2细胞率(51.0%vs 62.2%)、4~8细胞率(41.8%vs42.9%)及桑囊胚形成率(12.2%vs 21.4%)均无显著性差异(P>0.05)。结论:冻融复苏后的小鼠圆形精子细胞与冷冻前相似,具有一定的受精和胚胎发育能力。

小鼠微量圆形精子细胞冷冻保存方法研究

目的:探讨小鼠微量圆形精子细胞的冷冻方法和条件。方法:比较玻璃化冷冻和常规慢冷冻,不同浓度冷冻保护剂(5%、7%、9%甘油)及不同平衡时间(0、15、30、45、60 min)对体外培养所获微量小鼠圆形精子细胞的冷冻效果。结果:玻璃化冷冻和常规慢冷冻在7%甘油中平衡时间30 min均可获得较高的细胞复苏率,且玻璃化冷冻小鼠圆形精子细胞的复苏率显著高于常规慢冷冻方法[(72.9±15.4)%vs.(58.2±17.7)%,P<0.05]。结论:采用玻璃化冷冻方法,在7%浓度的甘油保护剂中平衡30 min,可获得较满意的微量圆形精子细胞冷冻效果。

人睾丸单倍体圆形精子细胞鉴别技术研究进展

圆形精子细胞注射(ROSI)技术是通过显微注射技术将单倍体圆形精子细胞注射入成熟卵母细胞中,使卵母细胞受精进而分裂形成胚胎的技术,是目前部分非梗阻性无精子症患者获得自己遗传学后代的最后希望。圆形精子细胞为单倍体雄性生殖细胞,是精原细胞经过减数分裂后变形成为精子前的最后一个阶段,主要通过睾丸穿刺取精术(TESA)或显微外科睾丸取精术(Micro-TESE)获得。虽然已经有ROSI试管婴儿出生,但总体来说ROSI技术效率(妊娠率、活产率)较低,因此到目前为止国内外还没有广泛推行该技术,其中不能准确鉴别活体单倍体圆形精子细胞是导致ROSI技术效率低下的主要原因之一。该文对目前几种鉴别人睾丸单倍体圆形精子细胞的方法进行综述。

绵羊tnp2基因的克隆及其在体外共培养系统中圆形精子细胞的转录分析

过渡蛋白2基因(tnp2)是圆形精子细胞特异表达的基因。为了开展绵羊圆形精子细胞标记基因的研究,根据GenBank上已公布的牛的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR和分子克隆方法,克隆了蒙古绵羊tnp2基因cDNA部分编码区序列。DNA序列测定结果与牛的核苷酸序列比对,同源性为95.3%。根据绵羊tnp2基因的cDNA序列设计引物,对共培养的四月龄绵羊睾丸生殖细胞进行RT-PCR鉴定。结果显示体外共培养的绵羊睾丸生殖细胞一直到第十周后仍有圆形精子细胞产生。绵羊tnp2基因的cDNA克隆和序列测定为进一步研究绵羊精子发生过程奠定了基础。

一种利用吖啶橙染色快速鉴定重力密度梯度沉降法中生精细胞类型的方法

目的建立一种重力梯度沉降法分离粗线期精母细胞,圆形及长形精子细胞的快速精确的镜检方法。方法利用重力密度梯度沉降法分离,将收集到的每管细胞分别放入96孔板中,每孔加入一定浓度的吖啶橙染液,于荧光显微镜下观察。结果通过分析对应荧光通道下3种生精细胞的细胞核/细胞质染色结果,可快速精确的分辨出粗线期精母细胞,圆形及长形精子细胞。结论建立了一种在重力密度梯度沉降法分离生精细胞过程中快速镜检检测粗线期精母细胞,圆形及长形精子细胞的方法。

五种染色方法对小鼠圆形精子染色效果的比较

比较五种染色方法对小鼠圆形精子(round spermatid,ROS)染色的效果,寻找一种鉴定圆形精子简单、有效的染色方法。以性成熟的昆明白鼠为实验材料,制备睾丸细胞悬液,分别用瑞氏、瑞氏-姬姆萨、姬姆萨、改良品红、苏木精五种方法对小鼠生精细胞进行染色,比较不同染色方法下圆形精子的形态。相比于其它四种染色方法,瑞氏-姬姆萨染色后能清晰地观察到圆形精子细胞膜和核膜的边缘,核质分明,与其它时期生精细胞区别明显。瑞-姬染色法是一种简单、有效的鉴定圆形精子形态的染色方法。

锌缺乏影响小鼠睾丸TGF-β1和FAK的表达并致圆形精子细胞脱落

目的:探讨锌缺乏致小鼠精子发生障碍的机制。方法:4周龄CD-1雄性小鼠随机分为实验组(n=20)和对照组(n=20),实验组喂食低锌饲料(锌离子浓度为0. 85 ppm),对照组喂食锌正常饲料(锌离子浓度为30 ppm)。喂养5周后取睾丸和附睾标本,原子吸收光谱法检测睾丸组织中锌离子浓度,HE染色观察睾丸和附睾组织病理改变;采用H1T2和TRA54抗体进行免疫荧光双重染色鉴定脱落细胞的性质,Western印迹检测睾丸中ZO-1、FAK、TGF-β1、TGF-β2、TNF-α、Par6的表达。结果:实验组锌离子浓度显著低于对照组[(140. 59±16. 22)μg/gvs(218. 44±31. 92)μg/g,P <0. 05]。HE染色见对照组睾丸组织结构正常,生精小管密集,生精上皮完整,各级生精细胞层次清楚、排列有序,异常的生精小管占全部生精小管比例为0. 01±0. 01;实验组睾丸生精上皮退化,精子细胞数量减少,支持细胞胞质空泡化,生精小管闭塞,异常的生精小管数(0. 75±0. 04)显著多于对照组(P <0. 01),并在异常的生精小管和附睾的头、体、尾部发现脱落的细胞。H1T2和TRA54免疫荧光双重染色结果显示实验组附睾中脱落的细胞可能是圆形精子细胞。Western印迹结果显示对照组和实验组的蛋白表达水平分别为:ZO-1(1. 130±0. 054、0. 904±0. 052),FAK(0. 219±0. 048、0. 144±0. 047),Par6(0. 145±0. 047、0. 129±0. 049),TGF-β1(0. 586±0. 048、0. 024±0. 058),TGF-β2(0. 142±0. 048、0. 116±0. 047),TNF-α(0. 458±0. 023、0. 469±0. 022),其中实验组FAK和TGF-β1蛋白表达水平显著低于对照组(P <0. 05、<0. 01)。结论:锌缺乏能够引起小鼠睾丸组织病理改变,导致睾丸圆形精子细胞脱落,FAK和TGF-β1蛋白可能在锌缺乏引起小鼠睾丸病理改变过程中有重要的作用。

Clock基因对雄性小鼠生殖功能影响

目的:通过干扰小鼠睾丸精子节律基因Clock的表达,研究Clock对雄性小鼠生殖能力的影响。方法:通过RNAi技术,向小鼠睾丸注射Clock干扰质粒干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达。研究干扰Clock基因后精子数量、精子活力、体外受精率和雌鼠胎仔数变化,以及对精子顶体内透明质酸酶活性、芳香基硫酸酯酶A的含量影响。结果:Clock干扰质粒在体内可影响雄性小鼠的胎仔数,但注射干扰质粒后小鼠精子计数、精子活力及体外授精率无明显变化,精子顶体内透明质酸酶活性和芳香基硫酸酯酶A含量也无明显变化。结论:节律基因Clock与雄性小鼠生殖能力有密切关系。

圆形精子注射技术应用研究进展

圆形精子是成熟精子的前体细胞,具有单倍体的遗传特性,通过卵胞质内圆形精子注射(round spermatid injection,ROSI)技术可以使卵母细胞受精并发育成胎儿。1996年,第一例通过ROSI技术出生的婴儿诞生,但临床应用一直在成功与失败中反复交替。至今,ROSI技术尚未广泛应用于临床,主要原因在于ROSI技术出生效率低,且出生婴儿的安全性未得到充分验证。ROSI技术在解决部分非梗阻性无精子症患者生育生物学后代的问题上展现出广阔的应用前景。本文对ROSI技术的应用研究进展进行综述,以期更全面系统地认识ROSI技术,推动其在临床更高效、更安全地应用。