荧光假单胞菌M18 rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M1 8对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomonesfluo rescens)M1 8能同时合成吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)两种抗生素。从M1 8的基因组中克隆了rpoD基因 ,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌 荧光假单胞菌穿梭质粒pME60 32 ,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下 ,导入M1 8菌株。发现经重组质粒转化的M1 8,与对照相比 ,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前 4h和 8h ,积累量提高 1倍和 6倍。

RAISE技术改组转录因子RpoD调控大肠杆菌的低pH值耐受性

在生物炼制生产过程中,微生物由于自身对酸的抗逆性差,其代谢生产过程会受到严重的影响。为解决该问题,本实验采用PCR方法从E.coli DH5α中扩增分离得到分子量为2 075bp的RpoD完整序列(包含天然启动子区域和终止子区域),并利用RAISE方法,通过突变全局调控因子RpoD来提高大肠杆菌的耐酸能力。通过对104随机突变文库的多轮筛选,获得最佳突变菌株MutantⅦ。在pH值为3.0、3.5、4.0、5.0、6.0和7.0的条件下,对MutantⅦ和对照菌株的生长情况进行比较分析,结果表明,在酸性条件下MutantⅦ较对照菌株具有明显的生长优势,尤其在pH值为3.0时,相比对照菌株0.015h-1的生长速率,MutantⅦ的生长速率达到0.022h-1,具有较高应用价值。

用gyrB、rpoD基因扩增测序进行气单胞菌分类的探讨

目的获得气单胞菌更准确的分类结果。方法收集经Vitek全自动细菌分析仪及配套的GN鉴定卡鉴定为气单胞菌的菌株231株,对其gyr B、rpo D两个管家基因进行PCR扩增及测序,并与Gen Bank中标准序列进行基因序列比对和单核苷酸替代率分析,综合分析gyr B、rpo D两基因测序结果并进行基因分类。结果 231株气单胞菌中,69株(29.9%)gyr B和rpo D基因均获得测序结果,86株(37.2%)仅获得gyr B序列,50株(21.6%)仅获得rpo D序列,26株(11.3%)两种基因均未获得序列。生化表型鉴定为嗜水气单胞菌的菌株中62.7%基因分类结果为达卡气单胞菌,仅22.4%为嗜水气单胞菌,其种间生化反应结果相近。结论气单胞菌属的生化分类与基因分类结果存在差异。达卡气单胞菌与嗜水气单胞菌的鉴定依赖于基因序列分析。

共轭亚油酸(CLA)负突变植物乳杆菌p8中转录因子rpoD基因序列的变化研究

对离子束诱变所产生的共轭亚油酸(CLA)下调的植物乳杆菌p8中,转录因子rpoD基因序列的变化进行分析。通过PCR扩增获得野生型和几株突变型菌株的rpoD基因,构建到pMD-19T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和测序分析筛选与鉴定阳性克隆子,并对野生型和突变型菌株的rpoD基因序列预测编码的氨基酸进行差异比较。结果表明,突变菌株的rpoD基因并未发生突变,CLA产量下调并不是由转录因子rpoD突变所引起。

rpoD和gyrA基因对气单胞菌鉴定的比较分析

目的使用rpo D和gyr A基因对气单胞菌进行种水平的鉴定,比较两者分类结果的差异,同时对本研究中187株气单胞菌进行较为准确的种水平的分类。方法对生化鉴定的187株气单胞菌进行rpo D和gyr A基因聚合酶链反应扩增并测序,将序列与种特异的参考序列一起构建系统发育树。结果 187株菌经rpo D基因鉴定为7个种,经gyr A基因鉴定为9个种,还有一个未定种。两者鉴定最多的3个种一致,即维氏气单胞菌温和生物变种、豚鼠气单胞菌和水族馆气单胞菌。gyr A基因鉴定增加的2个种是异嗜糖气单胞菌和简氏气单胞菌。rpo D和gyr A基因对气单胞菌鉴定一致的有174株(93%),但有13株菌(7%)两者鉴定不一致。结论 rpo D和gyr A基因能够对大部分气单胞菌进行准确一致的分类,对于两者鉴定不一致的菌株,应增加管家基因进行分析。

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原温和气单胞菌(Aeromonas sobria)分子鉴定及耐药性研究

采用常规生理生化特性测定及16SrRNA、gyrB及rpoD基因同源性检索与系统发育学分析等分子生物学方法,对引起养殖泥鳅大量死亡的病原细菌进行了综合鉴定。生理生化特性结果表明,分离菌株NQ090701与气单胞菌属的温和气单胞菌相近;16SrRNA、gyrB及rpoD基因Blast序列同源性检索与系统发育学分析均与温和气单胞菌相似性最高;综合形态与生理生化特征及16SrRNA、gyrB与rpoD基因的分子特征,确认分离菌株NQ090701为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。同时,采用试管稀释法测定了养殖生产中常用的10种抗菌药物对病原温和气单胞菌的体外最小杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC),结果表明氟哌酸杀菌作用最好,其次为盐酸沙拉沙星;甲砜霉素和复方磺胺甲恶唑在所试验的药物浓度范围对温和气单胞菌无杀菌效果。

香鱼假单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立香鱼假单胞菌的快速定量检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的rpo D基因序列设计了一对特异性引物,以该菌基因组DNA为模板通过PCR扩增其180 bp的rop D基因片段,并克隆于p MD18-T载体中,以纯化的重组质粒为标准品建立了香鱼假单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示在1.9×103拷贝/μL^1.9×108拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,灵敏度可达1.9×103拷贝/μL;该方法对恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌、创伤弧菌等病原菌DNA扩增结果均为阴性,特异性良好;组内和组间变异系数均小于2%,具有较高的重复性和稳定性。本研究建立的方法不仅能够快速检测香鱼假单胞菌,还能够对该病原菌感染的动态变化进行定量研究,为大黄鱼香鱼假单胞菌感染导致的内脏白点病的早期诊断及防控提供一个新的检测技术。

舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种快速、灵敏的舒伯特气单胞菌(Aeromanas schubertii)检测方法。【方法】以舒伯特气单胞菌rpoD(RNA polymerase sigma-70 factor)为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,建立舒伯特气单胞菌的TagMan实时荧光定量PCR检测方法,同时验证该方法的特异性、灵敏度、重复性,并用该方法对50份临床样品进行检测,验证其应用效果。【结果】含舒伯特气单胞菌rpoD基因的质粒拷贝数与循环阈值(Ct)的标准曲线相关系数为1.000,扩增效率为94.705%。实时荧光定量PCR检测方法只对舒伯特气单胞菌的靶基因检测结果呈阳性,对嗜水气单胞菌(Aeromanas hydrophila)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)等其他14种致病菌的检测结果均为阴性,具有高度特异性;对舒伯特气单胞菌重组质粒和纯培养细菌的检出灵敏度分别为4.76拷贝/μL和15 CFU/mL;批内和批间重复性试验变异系数分别为0.95%和1.05%。50份临床样品检测结果显示,该方法阳性样品检出率为22%,高于传统细菌分离方法(10%)的检出率。【结论】建立的舒伯特气单胞菌实时荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,适用于舒伯特气单胞菌的快速诊断检测和流行病学调查。

系统发育标记基因在芽胞杆菌分类鉴定中的应用

随着分子生物学的发展,传统鉴定芽胞杆菌的方法被一种可定量、较精确的以可翻译核苷酸序列为基础的分析方法所取代,即以进化速率不同的分子为研究对象,进行芽胞杆菌系统发育关系分析。近年来不断有系统发育标记基因被发现并使用,本文就近年来使用较多的分子标记基因,如gyrB、rpoB和gyrA、rpoD等基因在芽胞杆菌分类鉴定中的应用做一综述。

青虾源维氏气单胞菌双重PCR检测方法的建立

根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrB和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrB和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10-2 ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。

养殖斜带髭鲷源鳗利斯顿氏菌分离鉴定、系统发育分析及药敏试验

斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)作为我国东南沿海主要海水网箱养殖鱼类之一,常年受到以细菌性病害为主的侵袭,但相关病原检疫和诊断的研究较少。本文以福建罗源湾养殖濒死斜带髭鲷为研究对象,无菌解剖后对其肝、肾和脾脏进行细菌分离,对纯培养菌使用常规方法和API进行形态和生理生化鉴定,使用16S rDNA、gyrB和rpoD基因进行分子生物学鉴定和系统发育树构建及分析,并对该菌进行药敏试验。菌株鉴定结果为鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum),但在系统发育树中与多株鳗弧菌(Vibrio anguillarum)聚为一支,药敏试验表明该菌对新生霉素、左氟沙星、罗红霉素、氟苯尼考等7种药物敏感,对磺胺甲基异恶唑、利福平、四环素、强力霉素、氨苄西林等8种药物耐药。

基于全局转录工程促进肺炎克雷伯氏菌吡咯喹啉醌的生物合成

用易错PCR构建肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)RNA聚合酶rpoD基因的突变文库,将其与载体连接后转化肺炎克雷伯氏菌,从1500个阳性克隆中筛选出一株吡咯喹啉醌(PQQ)生产菌。发酵试验表明,该工程菌的PQQ产量为76mg/mL,比携带未突变rpoD基因的对照菌提高了10%。测序发现rpoD基因在核酸和蛋白质水平的突变率分别达到2.5%和0.5%。二级结构预测发现α螺旋、β转角和无规则卷曲数目均发生了变化,推测由此改变了σ因子与启动子的亲和程度,从而导致了PQQ基因的转录以及K.pneumoniae代谢流量再分配,使得PQQ得到更高效表达。

食品与环境中豚鼠气单胞菌系统发育分析以及毒力和耐药性研究

目的食品与环境中49株豚鼠气单胞菌菌种鉴定、毒力与耐药性检测。方法VITEK、API 20NE生化鉴定,gyrB、rpoD系统发育分析;PCR检测act、alt、ast、lip、ahp、aerA、hlyA、ompA1、fla基因;AST-GN16药敏试验。结果生化鉴定为豚鼠/嗜水气单胞菌株54株,经系统发育分析豚鼠气单胞菌49株,嗜水气单胞菌4株,中国台湾省气单胞菌1株。毒力基因alt、lip、ompA1、fla、act、aerA、hlyA检出率依次为100.00%、100.00%、79.59%、14.29%、2.04%、2.04%、2.04%,未检出ast、ahp;存在4种毒力基因组合,优势组合为alt/lip/ompA1(32/49)。豚鼠气单胞菌氨苄西林、头孢唑林、头孢西丁、阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、复方新诺明、安曲南耐药率依次为79.59%、14.29%、10.20%、6.12%、4.08%、4.08%、2.04%,哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、替加环素、呋喃妥英均敏感;2株多重耐药菌株。结论gyrB、rpoD可有效鉴定豚鼠/嗜水气单胞菌,rpoD可区分近亲缘关系豚鼠与中国台湾省气单胞菌;所有豚鼠气单胞菌均携带2种以上毒力基因,1株环境源菌携带7种毒力基因;青霉素类普遍耐药,产生β-内酰胺酶是最主要耐药机制;未发现碳青霉烯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、呋喃类耐药菌株;食品和生活饮用水存在多重耐药菌。