Red/ET同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰

随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体(BAC)进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节.应用新近优化的Red/ET同源重组技术对目标BAC进行修饰,以pSC101-BAD-gbaA为依托质粒,采用rpsL鄄neo为正/反向筛选系统,可以快速、高效地对BAC进行剪切、插入、替换等操作,其中能够进行抗性筛选的一步BAC修饰只需一周时间,以插入非抗性标记基因Cre为代表的两步BAC修饰在两周内即可完成.通过阿拉伯多糖诱导调控和简单地变化培养温度,能使pSC101-BAD-gbaA依托质粒在发挥完Red/ET同源重组作用后自然消失,最终获得完整而纯净的修饰后BAC,为加快功能基因组学研究提供了一个可靠的实验平台.

细菌人工染色体的修饰及其转基因应用研究

细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)是一种新发展起来的DNA载体系统,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点。广泛的应用于基因组文库构建、基因功能分析等方面。随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体进行有目的修饰已成为功能基因组学研究的一个重要环节。BAC载体转基因技术可能成为避开基因打靶获得高效表达的转基因生物的另一途径。本文介绍了BAC作为转基因栽体的几种修饰方法及其在转基因研究上的应用。

利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选敲除AcMNPV lef-10基因

【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10点突变载体,为进一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基础。【方法】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef-10进行点突变,由于lef-10和必需基因vp1054有重叠,所以在敲除lef-10时只能通过引进点突变使lef-10失活,避免影响vp1054的正常表达。首先,构建rpsL-AMP筛选盒,然后在野生型AcBacmid中引进点突变(方法是通过2次Red/ET重组:第1次重组在野生型AcBacmid lef-10中引进rpsL-AMP抗性筛选标记,形成一次重组Bacmid,第2次重组是在一次重组Bacmid中引进含点突变的lef-10片段),再利用链霉素反向筛选去除rpsL-AMP抗性筛选标记,同时引入相应的点突变。将从lef-10基因点突变重组菌中提取得到的AcBacmid与质粒pTriEx1.1和pTriEx-innateP-lef10分别共转染草地贪夜蛾Sf9细胞,同时用野生型AcBacmid与质粒pTriEx1.1共转染Sf9细胞作为对照,显微镜下观察病毒的复制情况,确定lef-10基因是否为AcMNPV的必需基因。【结果】通过对重组Bacmid的PCR鉴定和点突变序列的测定,证明AcMNPVlef-10基因已经发生点突变;通过共转染试验发现,随着转染时间的延长,lef-10补回型病毒和野生型病毒一样,均能在Sf9细胞中复制产生具有感染性的子代病毒粒子BV,从而对邻近细胞造成二次感染,使得细胞死亡,且lef-10补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型基本一致;而由于lef-10缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子,所以在被lef-10缺失型重组病毒转染的细胞中,细胞数目不会随着转染时间的增加而发生明显改变。【结论】利用Red/ET重组系统结合rpsL反向筛选系统可以在Ac MNPVlef-10基因中引入点突变,且lef-10是杆状病毒生活周期中的一个必需基因,其缺失会影响杆状病毒的复制。

O_3/BAC工艺中炭滤池pH值调节技术的研究

针对采用O3/BAC工艺的某自来水厂中炭滤池出水pH值大幅度降低的现象,根据炭滤池pH值变化的关键因素对其调节技术进行了研究,开发出了活性炭滤料原位酸碱改性技术,并从净水效果和经济性两方面对砂滤池前投加烧碱或石灰进行了对比研究。结果表明:先对活性炭进行烧碱浸泡改性,使其pH值平衡点提高至所需值,再在砂滤池前投加石灰调节待滤水pH值至该平衡点左右,经过炭滤池酸碱缓冲后出水pH值维持在该平衡点处,达到了调节pH值的效果,出水COD Mn、NH3-N、浊度等指标均能达标,且水质硬度从90.7 mg/L增加到了178.4 mg/L,对防止给水管网腐蚀有利。

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.