信前胡烟草花叶病毒lncRNA测序鉴定、原核蛋白表达及其序列分析

本研究对信前胡烟草花叶病毒进行鉴定、原核蛋白表达和序列分析,为信前胡脱毒苗的培育和鉴定提供理论依据。通过lncRNA测序和RT-PCR鉴定信前胡烟草花叶病毒蛋白基因,利用大肠杆菌重组技术表达信前胡烟草花叶病毒蛋白,并采用生物信息学方法进行序列分析。信前胡烟草花叶病毒蛋白基因包括复制酶(ORF1)、运动蛋白(ORF2)和外壳蛋白(ORF3);信前胡烟草花叶病毒复制酶、运动蛋白和外壳蛋白均可通过RT-PCR检测到,并可实现大肠杆菌重组表达,表明信前胡烟草花叶病毒的lncRNA测序结果准确;信前胡烟草花叶病毒复制酶、运动蛋白和外壳蛋白基因cDNA总长度分别为3351 bp、807 bp和480 bp;信前胡烟草花叶病毒复制酶、运动蛋白和外壳蛋白与烟草花叶病毒的亲缘关系较近,同源性分别为99.64%、98.88%、98.74%。信前胡烟草花叶病毒(Peucedanum praeruptorm tobacco mosaic virus,PpTMV)在江西省上饶市信前胡主产区信州、广信、玉山、广丰、婺源、德兴、弋阳的7个区或县均有发生。这是首次报道在信前胡上检测到PpTMV。

新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒与禽流感病毒三重RT-qPCR鉴别检测方法的建立与应用

新城疫、禽传染性支气管炎与禽流感是可引起禽类呼吸道症状相似的三种急性传染病,且存在混合感染。为建立新城疫病毒、禽传染性支气管炎病毒与禽流感病毒三重RT-qPCR检测方法,该研究对比了GenBank登录的新城疫病毒(NDV)L基因、禽传染性支气管炎病毒(IBV)1a基因和禽流感病毒(AIV)NP基因,经分析选取保守序列设计了三套引物与探针,通过优化检测方法的反应体系,成功建立了可同时检测NDV、IBV和AIV的三重RT-qPCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了评估。结果表明,该方法能够特异性检测出NDV、IBV和AIV,有较好的特异性;方法对三种病毒的最低检测限均为3.02×10^(2)copies/μL,有较高的敏感性;重复性实验结果显示批内与批间变异系数均不大于1.28%,有良好的重复性。使用本研究建立的方法对102份临床咽拭子进行检测,并与常规RT-PCR进行比较,总符合率为96.6%。本研究建立的三重RT-qPCR检测方法,特异性强,灵敏度高,可用于NDV、IBV、AIV三种病毒的检测。

川芎嗪联合环胞霉素A逆转白血病多药耐药的研究

目的 :寻找有效的多药耐药联合逆转剂。方法 :用逆转录 -聚合酶链反应 (RT -PCR) ,Westernblot和MTT法研究川芎嗪逆转耐药细胞系HL - 6 0 /VCR的作用 ,对多种化疗药物耐药的白血病用川芎嗪与环孢菌素A(CsA)加化疗药物联合用于治疗 2 1例复发难治性白血病。结果 :单用川芎嗪在体外能不同程度地增强HL- 6 0 /VCR细胞对多种化疗药物的敏感性 ,降低p170蛋白的表达。川芎嗪联合环胞素A有较好逆转复发难治性白血病多药耐药的作用 ,治疗组完全缓解率 44 4% ,部分缓解 33 3%。结论 :川芎嗪联合环胞素A可能成为安全有效的逆转药物 ,在治疗复发难治性白血病中有较大的临床意义和推广价值。

葛根素对实验性大鼠肺纤维化影响

目的观察葛根素对肺纤维化大鼠的影响。方法大鼠随机分为对照组、模型组、葛根素组,以博来霉素气管内滴入建立大鼠的肺纤维化模型,第29天取肺组织作病理切片及HE染色和胶原纤维染色,以免疫组化法(SP法)检测I型胶原纤维,以RT-PCR法检测TGFβ1,并进行图像分析定量,进行统计分析。结果葛根素组相比模型组在总胶原纤维、I型胶原纤维和TGFβ1mRNA的表达均有下降。结论葛根素可抑制炎症和成纤维细胞增殖,抑制TGFβ1mRNA的表达,并可减少肺胶原纤维的形成,起到抑制和延缓实验大鼠肺纤维化的作用。

北美型猪蓝耳病病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立及应用

参考Genbank发表的美洲型猪蓝耳病病毒(porcine reproductive and respiratory syndrone virus,PRRSV)CH-1a(北美型经典PRRSV)、JXA1(北美型HP-PRRSV)等毒株的的主要结构蛋白基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对特异性的北美型PRRSV鉴别检测引物,其对经典PRRSV的扩增片段为511bp,对HP-PRRSV的扩增目片段为421bp。进行了该方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了美洲型PRRSV鉴别RT-PCR检测方法。应用此法对2010年1—12月收集的126份临床样品进行了检测,总体检出率达53.17﹪。结果表明该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于北美型PRRSV的临床发病鉴别检测及流行病学监测等工作。

RhoC基因mRNA在食管鳞癌中的表达及其意义

目的:探讨RhoC基因在食管鳞癌组织中的表达情况及其与食管鳞癌发生、发展的关系.方法:采用半定量RT-PCR和原位杂交方法检测62例食管鳞癌、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜组织中RhoC mRNA的相对表达量及细胞定位.结果:食管鳞癌组织中RhoC mRNA表达与癌的组织学分级、浸润深度及淋巴结转移密切相关(P<0.05);在食管鳞癌癌变过程中RT-PCR检测RhoC mRNA在癌组织、癌旁不典型增生组织及正常黏膜组织中的表达量依次降低,分别为0.902±0.119、0.731±0.065、0.653±0.069,组间比较有明显差异(H=99.629,P<0.01);原位杂交检测RhoC转录本主要位于细胞质中,其在癌组织、癌旁不典型增生组织及正常黏膜组织中的表达率依次降低,分别为80.6%(50/62)、32.3%(10/31)、21.0%(13/62),组间比较有明显差异(χ2=47.735,P<0.01),两种方法检测的RhoC mRNA表达具有一致性.结论:RhoC mRNA在食管鳞癌组织中显著增加,并与食管鳞癌生物学行为关系密切,提示RhoC mRNA过表达与食管鳞癌的发生、发展有关,RhoC mRNA可作为食管鳞癌早期诊断和判断预后的辅助指标.

人血管生成素1真核表达载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞的表达

目的 探索构建人血管生成素1( human angiopoietin 1,h Ang- 1)真核表达载体,转染体外培养兔骨髓间充质干细胞( marrow mesenchymal stem cells,MSCs)修复骨缺损的可能性。 方法 基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pc DNA3- h Ang- 1,经脂质体DOTAP介导质粒转染兔MSCs,G4 18筛选阳性克隆,RT- PCR及免疫印迹杂交检测h Ang- 1m RNA及蛋白表达。 结果 重组真核表达载体pc DNA3- h Ang- 1经限制性内切酶Xho- I和Bam H- I酶切后,电泳显示1.4 kb h Ang- 1目的片段和5 .4 kb pc DNA3载体片段,转染兔MSCs后,RT- PCR检测出目的基因m RNA,免疫印迹杂交检出h Ang- 1的蛋白表达。 结论 构建的真核表达载体pc DNA3- h Ang- 1能在转染的兔MSCs中表达。

小鼠T2细胞特异性转录因子GATA3基因的克隆和序列分析

目的:克隆小鼠Th2细胞分化转录因子GATA3基因的全长编码区cDNA。方法:利用RTPCR方法,从Balb/c小鼠脾细胞的mRNA中扩增GATA3基因全长cDNA,并将其连接到pMD18-T载体上,进行测序和核酸分析。结果:扩增得到的小鼠GATA3基因cDNA全长1332bp,编码444个氨基酸,其结构含有识别和结合DNA所需的高度稳定的蛋白区;blast结果分析表明,该cDNA与Genbank中发表的序列(BC062915)具有100%的同源性。结论:获得小鼠GATA3基因的克隆,为进一步研究转基因免疫干预奠定了基础。

辛伐他汀对大鼠心肌细胞肥大及蛋白激酶B表达的影响

目的观察辛伐他汀对血清诱导培养大鼠心肌细胞肥大的影响,探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB)途径在辛伐他汀调控心肌细胞肥大中的信号转导作用。方法以培养的新生SpragueDawley(SD)大鼠心肌细胞为实验模型,应用图像分析系统测定心肌细胞表面积,[3H]亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白合成速率,逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)检测心钠素(ANP)mRNA表达,RTPCR和蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测PKB的mRNA和蛋白表达水平。结果(1)15%血清组干预24h后心肌细胞表面积(1611.16±160.75)μm2显著高于无血清对照组(538.04±118.60)μm2,并有统计学意义(P<0.01);给予辛伐他汀和血清共同干预后,随着辛伐他汀浓度的增加,心肌细胞表面积呈递减趋势,其中10-5mol/L和10-6mol/L组分别为(799.84±167.70)μm2和(1076.88±199.28)μm2,均显著低于血清组(P<0.01)。(2)在15%血清刺激后,心肌细胞[3H]亮氨酸掺入率为(2360±106)计数/min·孔,明显高于无血清对照组(1305±92)计数/min·孔,并有统计学意义(P<0.01);10-5和10-6mol/L辛伐他汀组[3H]亮氨酸掺入率分别为(1707±101)计数/min·孔和(1962±125)计数/min·孔,均较血清组明显降低(P<0.01)。(3)随着辛伐他汀浓度的增加,心肌细胞ANP的mRNA表达水平逐渐降低,其中10-5和10-6mol/L辛伐他汀组分别为0.29±0.03和0.40±0.03,与单纯血清干预组(0.60±0.03)比较明显降低,差异非常显著(P<0.01)。(4)心肌细胞PKB的mRNA和蛋白表达水平均随辛伐他汀浓度的增加而呈递减趋势,其中10-5、10-6mol/L辛伐他汀组PKBmRNA表达水平为0.28±0.02和0.36±0.03,明显低于血清干预组(0.51±0.03),并有统计学意义(P<0.01)。上述两组PKB蛋白表达水平分别为42.41±2.83和45.68±3.43,也较血清组(60.80±3.49)显著降低(P<0.01)。结论辛伐他汀能够抑制血清诱导的心肌细胞肥大,PKB表达水平下调可能是其分子生物学机制之一。

短间隔连续部分肝切除(SISPH)中ADAMs基因表达差异分析

用ADAMs通用引物进行RT PCR ,以检测短间隔连续部分肝切除 ( 4 3 6 3 6 3 6SPH)中不同恢复时间ADAMs基因转录情况。结果表明 :( 1)ADAMs基因转录无个体和性别差异 ,也无肝再生恢复期依赖性 ;( 2 )PCR产物克隆、测序证实 ,肝脏中有MDC9同源序列存在 ;( 3 )用MDC9特异性引物PCR检测表明 ,MDC9在正常和不同恢复时期肝脏中均有一定水平转录 。

食管癌多药耐药基因和多药耐药相关蛋白基因的研究

目的 :探讨食管癌组织中多药耐药基因 (mdr 1)和多药耐药相关蛋白基因 (mrp)表达的意义。方法 :运用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)技术检测了 32例食管癌患者的癌组织标本及癌旁组织中mdr 1和mrp表达 ,分析其与肿瘤分化程度、浸润深度及淋巴结转移的关系。结果 :32例食管癌组织中mdr 1和mrp表达的阳性率均高于癌旁组织 (P <0 0 1,P <0 0 2 5 ) ,两基因的表达水平也显著高于癌旁组织 (P <0 0 0 1,P <0 0 0 1) ;在中低分化食管癌和肿瘤侵犯深肌层或纤维层时 ,mdr 1、mrp表达水平均高于高分化肿瘤和癌肿侵犯浅肌层以内者 (P <0 0 5 ,P <0 0 1)。结论 :食管癌组织中存在着原发性多药耐药性 ,mdr 1和mrp表达增高可能提示肿瘤的分化不良 ,并可反映肿瘤的浸润深度。

膀胱肿瘤多药耐药基因的表达及其临床意义

目的 探讨膀胱肿瘤多药耐药基因 (MDR- 1m RNA)的表达与临床化疗的相关性。方法 采用逆转录多聚酶链反应 (RT- PCR)技术 ,对 2 6例正常膀胱粘膜和 30例膀胱肿瘤 MDR- 1m RNA的表达进行了检测。结果 2 6例正常膀胱粘膜中 MDR- 1m RNA表达为 15 .4% ,16例初发膀胱癌 MDR- 1m RNA有表达为37.5 % ,14例复发膀胱癌的 MDR- 1m RNA表达为 78.6 % ,并对其进行了临床生物学行为的观察和比较。结论 多药耐药现象在正常膀胱粘膜中有表达 ,在部分初发膀胱癌中有先天性存在 ,RT- PCR方法检测膀胱肿瘤时具有相对敏感、特异、方便。

太子参芜菁花叶病毒时空动态定性初步检测

为明确柘荣县太子参携带芜菁花叶病毒情况,采用RT-PCR法对不同太子参植株进行芜菁花叶病毒检测。结果表明:同株太子参有无病斑的叶片、根部、茎部都可检测到病毒;未表现病毒症状与表现病毒症状太子参植株的9个部位均可检测到病毒,未表现病毒症状的太子参植株中叶脉及茎下部病毒含量相对较高;不同海拔地区种植的太子参植株10个部位均可检测到病毒,花部位的病毒含量相对较少;对不同生长期太子参定株叶片进行病毒检测发现生长末期部分植株未检测到病毒,除此之外所取样品均携带芜菁花叶病毒。

半胱氨酰白三烯受体基因mRNA在COPD患者的不同表达

目的:观察在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的半胱氨酰白三烯受体(CysLT2R)基因mRNA的表达,探讨CysLT2R在COPD急性加重期、缓解期及健康对照组之间表达的差异,对比CysLT12R和CysLT22R两者在COPD患者中的表达。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术在COPD患者60例及健康人30例血清中检测CysLT12R和CysLT22R的表达情况。结果:在COPD组和健康对照组均能检测到CysLT12R和CysLT22R基因mRNA表达,两组对比差异有显著性(P<0.05),并且两种受体有显著性表达(P<0.05)。结论:在COPD患者外周血白细胞中CysLT12R和CysLT22R的表达基因mRNA表达水平显著增高,并且CysLT12R和CysLT22R表达存在差异,COPD急性加重期、缓解期之间无显著差别。

甘薯新品种茎尖培养及病毒检测技术

为了优化甘薯茎尖培养方法,获得甘薯新品种脱毒试管苗。采用正交试验法,研究NAA、GA3和6BA三种因素对甘薯茎尖分化和植株再生的影响,筛选培养基最佳配方;在正交试验基础上,进一步考察不同甘薯品种在最佳培养基组合的茎尖分化和植株再生情况;并用RTPCR方法对成苗的甘薯品种再生株系进行病毒病(SPFMV、SPCSV、SPVG、SPVC和SPLV)检测。结果表明:各试验因素对福薯604茎尖分化成苗影响的主次关系为6BA>NAA>GA3,福薯604茎尖组培成苗的最佳组合为MS培养基+6BA 1.2 mg·L^-1+NAA 0.10 mg·L^-1+GA30.1 mg·L^-1,其茎尖组培苗萌芽率为93.3%、成苗率达50.0%。不同甘薯品种在最佳培养基组合条件下的茎尖分化情况表现不同,其中,福菜薯23和福薯116甘薯品种的茎尖分化和植株再生情况最好。不同甘薯品种试管苗经RTPCR检测,最终获得福薯8号、福薯34、福菜薯22、福薯916、福薯90、福菜薯23、福薯116、福薯317、福薯604、福薯16号、福薯33和福薯113等12份甘薯脱毒试管苗,可应用于实际生产。

地高辛标记RT-PCR检测甲肝减毒活疫苗的研究

以编码甲肝病毒ＶＰ３ 羧基端的基因区为目标区，运用地高辛标记ＲＴＰＣＲ 法对甲肝疫苗进行检测，并与ＴＣＩＤ５０ 检测法进行比较。建立甲肝减毒活疫苗滴度的地高辛标记ＲＴＰＣＲ 检测法。结果显示：地高辛ＲＴＰＣＲ 法灵敏度略高于ＴＣＩＤ５０ 法，特异性与ＴＣＩＤ５０ 相似，且快速简便，易于推广应用。结果表明：地高辛标记ＲＴＰＣＲ 法是一种简便、快速、灵敏的甲肝病毒检测方法，可用作疫苗的常规检测。

异丹叶大黄素和白藜芦醇对小鼠腹腔巨噬细胞白细胞介素6mRNA表达的影响

目的：观察异丹叶大黄素和白藜芦醇对分别由炎性三肽（ｆＭＬＰ）和钙离子载体Ａ２３１８７（Ａ２３１８７）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞白细胞介素６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６，ＩＬ６）ｍＲＮＡ表达水平的影响。方法：用半定量ｍＲＮＡ的ＲＴＰＣＲ。结果：异丹叶大黄素和白藜芦醇在２×１０－６和２×１０－５ｍｏｌ·Ｌ－１浓度下，均能抑制ｆＭＬＰ和Ａ２３１８７诱导的小鼠腹腔巨噬细胞ＩＬ６ｍＲＮＡ的表达。结论：该２个化合物抑制ＩＬ６活性的作用机制之一是抑制ＩＬ６ｍＲＮＡ表达。

鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和中国流行株鉴别诊断的研究

根据国外已发表的ＩＢＶ核蛋白基因序列设计一对特异性引物，引物跨度为１５Ｋｂ，包括整个开放阅读框架。由于疫苗株Ｍ４１在核蛋白基因３′末端非编码区缺失近０２Ｋｂ的基因片段，因此ＲＴＰＣＲ扩增将得到１３Ｋｂ的基因产物。我们应用这对引物扩增９株ＩＢＶ的核蛋白基因，结果表明，除８株ＩＢＶ扩增出１５Ｋｂ的预计大小的基因产物外，疫苗株Ｍ４１则扩增出１３Ｋｂ的基因产物，与实际设计相符。经酶切分析、分子杂交及序列分析鉴定证实我们获得的ＰＣＲ产物为ＩＢＶ的核蛋白基因。