豇豆与锈菌互作中的活性氧代谢研究

本文分析了不同抗性水平的豇豆(Vigna sesquipdalis Wight)品种与锈菌(Uromyces vignae Barcl)互作中活性氧(ac-tive oxygen species,AOS)的发生、防御酶活性及膜脂过氧化水平的变化规律及其与豇豆抗锈病性的关系。结果表明,在接种后,免疫品种(益农)和感病品种(揭上和金迪)的超氧物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)比活性均升高,且升高幅度都在12 h出现高峰;抗病品种(金山和特青)开始时降低,至12h时回升,在24 h(高抗)和48 h(中抗)出现高峰;在24 h时,免疫和抗病品种的SOD比活性高于感病品种。在接种后12 h内,免疫和抗病品种的过氧化氢酶(catalase,CAT)比活性都下降;而感病品种均上升,并在12 h出现第1个高峰。受锈菌侵染后,豇豆各品种都产生超氧阴离子(superoxide anion,O2-),在多数测试时段中,免疫和抗病品种的O2-产率净变化值低于感病品种。丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化幅度与品种抗性呈负相关,与O2-产率的变化趋势基本相吻合。这些结果表明AOS代谢在豇豆与锈菌互作中起重要作用。

小豆Dirigent基因家族鉴定及锈菌侵染对不同成员表达的影响

为明确Dirigent (DIR)基因在小豆抗锈病中的作用,采用生物信息学方法,对小豆DIR基因家族(VaDIRs)进行了全基因组鉴定,结果发现小豆中共有33个DIR基因,其中29个成员分别定位在8条染色体上,系统进化分析表明,VaDIRs包括DIR-a、DIR-b/d、DIR-e和DIR-f四个亚家族,对VaDIRs成员启动子区顺式作用元件的分析发现,VaDIRs启动子区均包含激素、病原体应答等元件。对小豆抗锈病品种接种后不同时间的转录组数据分析发现,差异表达基因中共有17个VaDIRs成员,其中6个于接种后24 h显著上调,2个于接种后24 h和48 h均高量表达。进一步应用qRT-PCR技术对上述8个基因在抗、感品种中应答锈菌侵染的表达分析表明,高抗品种中VaDIR14、VaDIR16和VaDIR33的表达量在锈菌侵染不同阶段均显著高于感病品种。上述结果表明,VaDIRs家族成员可作为正调节因子参与小豆对锈病的抗性。

苯丙氨酸解氨酶和过氧化氢酶活性与豇豆抗锈病性的关系

在豇豆(VignasesquipdalisWight)不同梯度抗性品种与锈菌(UromycesvignaeBarcl)互作的早期(于接种后12h内),苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase,PAL)的比活性与品种抗性梯度一致;过氧化氢酶(Catalase,CAT)的比活性变化率与品种抗性有较密切的关系,在免疫和抗病品种中降低,在感病品种中则上升.

红小豆锈病菌夏孢子萌发条件研究

豇豆单胞锈菌是引起红小豆锈病的病原菌。为了明确红小豆锈病菌夏孢子的萌发条件,以红小豆锈病菌ZXL01菌株为材料,研究了培养方法、温度、光照、储存条件和储存时间对红小豆锈病菌夏孢子萌发的影响。结果表明,最适红小豆锈病菌夏孢子萌发的培养方法为水琼脂平板法,夏孢子在水琼脂上2 h即开始萌发,随着培养时间的延长,萌发率逐渐升高,6 h后萌发率趋于稳定,萌发率为75.0%。夏孢子在15~25℃均可萌发,最适萌发温度为20℃。光照可明显抑制夏孢子萌发。夏孢子在4℃条件下储存360 d后已基本丧失萌发能力,而夏孢子在-20℃条件下储存360 d时仍可保持萌发活力。

小豆锈病分子检测体系的构建及应用

由豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae Barclay)引起的小豆锈病是小豆生产中危害最为严重的病害之一,建立早期分子检测技术体系对病害早期诊断和及时防控具有重要意义。本研究以豇豆单胞锈菌ITS序列为依据设计引物,结合已报道的单胞锈菌属特异检测引物,以豇豆单胞锈菌为目标菌,以茄链格孢、茄丝核菌、禾谷镰刀菌、稻瘟菌、苹果轮纹病菌、半裸镰刀菌、玉米链格孢菌、尖孢镰刀菌和禾顶囊壳等9种常见植物病原真菌为参照菌,采用CTAB法提取上述各菌株的基因组DNA,应用普通PCR技术筛选出豇豆单胞锈菌的特异性检测引物UV-ITS,在此基础上设计巢式PCR引物UV-MX,构建了基于巢式PCR的高灵敏度小豆锈病分子检测体系。该巢式PCR体系在基因组DNA浓度仅为4×10^(-6)ng·μL^(-1)时仍可实现有效扩增,其灵敏度是普通PCR的10万倍。以感病小豆品种‘宝清红’接种锈菌后不同时间的叶片为材料检验检测体系的应用效果发现,接种后12 h的小豆叶片样本即可扩增出豇豆单胞锈菌的特异性条带。本研究建立的小豆锈病分子检测体系特异性强、灵敏度高,具备对潜伏期病害进行早期诊断的应用潜力,可为小豆锈病的早期快速诊断和及时防控提供重要的技术支撑。

黑龙江省一株红小豆锈病病原菌鉴定

【目的】为明确发生在黑龙江省大庆市红小豆田中的锈病病原物的分类地位。【方法】从大庆市采集红小豆锈病标样,采用单孢子堆分离法获得一株红小豆锈病菌纯培养物ZXL01。采用观测夏孢子芽孔数目、位置和冬孢子壁厚度等形态学特征结合ITS序列分析的方法,对其进行鉴定。【结果】ZXL01夏孢子发芽孔多为2个,位于孢子赤道部位较远之处,冬孢子壁厚度为2.9μm-3.3μm。在基于r DNA-ITS序列构建的系统发育树中,ZXL01菌株与两株豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae)的参比菌株(Gen Bank登录号:AB115718和AB115731)在自举值99%相聚一群。用豇豆单胞锈菌的特异性引物UV-ITSF/R进行检测,ZXL01菌株可扩增出500 bp左右的特征片段。【结论】黑龙江省大庆市红小豆锈病病原菌ZXL01菌株为豇豆单胞锈菌,ZXL01菌株的Gen Bank登录号是KM461700。

小豆锈病病原菌鉴定

小豆锈病是小豆的重要病害。然而，小豆锈病病原菌在我国还没有被鉴定。本文对从黑龙江省和内蒙古自治区采集的5个小豆锈病菌样品的分类地位进行了研究。形态学观察表明，小豆锈病菌夏孢子芽孔位于赤道线或赤道线上方，冬孢子平均壁厚为2．0μm。分子标记检测发现，小豆锈病菌不能被疣顶单胞锈菌特异性引物对UA—ITSF／UA—ITSR扩增，小豆锈病菌和豇豆锈病菌不能被豇豆单胞锈特异性引物对UV—ITSF／UV—ITSR区分。对豇豆单胞锈特异性引物对扩增的4个小豆锈病菌样品PCR产物进行测序，比对分析表明目标序列与小豆单胞锈ITS序列的同源性为99％～100％。基于夏孢子的芽孔位置、冬孢子壁的厚度、疣顶单胞锈菌及豇豆单胞锈特异性引物检测结果和ITS序列分析，小豆锈病菌被鉴定为小豆单胞锈。

小豆AP2/ERF基因家族鉴定及其应答锈菌侵染的表达分析

为明确小豆VaAP2/ERF家族基因在小豆应答豇豆单胞锈菌(Uromyces vignae)侵染中的作用,本研究采用生物信息学方法从小豆基因组中鉴定VaAP2/ERFs家族基因186个,包括AP2(24个)、RAV(2个)、Soloist(1个)及ERF(159个)四个亚家族,其中ERF亚家族又可分为DREB和ERF两个亚类。基因结构分析发现,68.3%的VaAP2/ERFs基因不具内含子。保守基序分析发现,各亚族成员保守域组成类似,可作为基因家族分类的重要依据。前期转录组测序发现VaAP2/ERF中的6个成员接种后24 h显著上调,进一步应用qPCR技术对其在‘1-D-3’(免疫)及‘宝清红’(感病)中应答锈菌侵染的表达分析发现,免疫品种中6个成员均于接种后6 h及120 h显著上调,另有2个于接种后12 h也显著上调,表明上述基因均在小豆抗锈病中发挥正调控作用。

小豆种质资源对锈病的抗性评价

为筛选小豆(Vigna angularis)抗锈病性资源,本研究以54份小豆种质资源为材料,通过室内接种豇豆单胞锈菌(Uromyce vignae)菌株ZXL01,并分析叶片表面花斑轻重和每1.5 cm2夏孢子堆的数量,以评价小豆种质资源对锈病的抗性。结果表明,供试材料对小豆锈病的抗性存在明显差异。15份种质资源表现抗病,其中,吉林373和QH2对锈病表现免疫,占供试品种的3.7%;龙垦早红、北4、LZX031、建37、建265和QH1高抗锈病,占供试品种的11.1%;保M908-15、极旱红小豆、吉红6号、北12、湾选1号、保8824-17和北10为中抗种质资源,占供试品种的12.9%。其余39份种质资源均对小豆锈病表现感病。本研究筛选获得小豆抗锈病资源可为田间生产和抗病品种培育提供重要参考。

小豆VaWRKY33基因克隆及其响应锈菌侵染的表达分析

为明确小豆VaWRKY33基因对抗锈病的作用,本研究以小豆基因组DNA为模板克隆了该基因全长。VaWRKY33的基因序列全长2 442 bp,包含4个内含子,编码区全长1 620 bp,编码539个氨基酸。VaWRKY33蛋白质相对分子质量为60.16 kD,理论等电点为7.66,属于亲水性不稳定蛋白,有一个跨膜结构域,包含蛋白磷酸化位点85个。蛋白序列分析表明,VaWRKY33包含两个保守的WRKY结构域,锌指结构类型为C2H2型,属WRKY转录因子家族GroupⅠ亚家族。VaWRKY33启动子区分析发现,除核心作用元件外,主要包括光响应、逆境及组织特异性等三类顺式作用元件。基因表达分析表明,VaWRKY33在抗病品种‘庆红1号’(QH1)上于接种病菌12 h时开始显著上调,并在整个侵染过程中始终显著高于不接种对照;在感病品种‘宝清红’(BQH)上于接种病菌48~192 h时,VaWRKY33基因显著上调表达,但其响应时间较抗病品种明显滞后,推测VaWRKY33在病菌侵染早期的迅速响应在小豆抗锈菌侵入阶段发挥正调控作用。