转基因抗虫小麦中sgna基因的遗传分析及抗虫性鉴定

利用基因枪介导将抗蚜虫的sgna基因导入了长江中下游地区小麦栽培品种扬麦 15 8,得到了 6棵转基因植株。PCR和RT PCR检测分别证实了sgna基因的整合和表达。通过分析转基因植株的T1 代和T2 代 ,发现sgna基因的遗传并不符合孟德尔的遗传规律。抗蚜虫鉴定试验证明含有sgna基因的植株对蚜虫有明显的抗性 ,转基因植株可以显著降低蚜虫的繁殖率。转基因植株的农艺性状与对照相比 。

sgna基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子 Ubi对含目的基因 sgna的现有载体进行了改造 ,并引入筛选标记基因 bar;为提高目的基因的表达水平 ,在目的基因 5′端引入了Ω和 kozak序列 ,3′端引入了 poly( A)序列 ,成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体p GU4AGBar和 p GBIU4AGBar。其中 p GU4AGBar含有顺向连接的 Ubi- sgna及 Ubi- bar基因表达盒 ,p GBIU4AGBar含有 T- DNA边界序列 ,并在其左右边界中间插入了含有顺向连接的 Ca MV35 S- npt 、Ubi- sgna和 Ubi- bar基因表达盒。

转sGNA基因小麦农艺性状评价与抗蚜效果分析

【目的】研究外源基因遗传表达的稳定性、转基因小麦农艺性状和抗蚜效果,为转基因小麦商品化生产提供参考。【方法】于2009/10年度在北京市进行转基因安全评价中间试验,田间调查转基因小麦生长发育、形态特征等各种农艺性状和田间的抗蚜虫效果,并与室内抗蚜鉴定进行比较分析。【结果】T4代转s GNA基因小麦株系2-5、3-7、3-20和5-20均为纯合株系。在田间栽培条件下,个体生长发育正常,生长发育各个阶段所需的天数与对照基本一致,生长特性没有发生变化;但转基因小麦在株高、分蘖数、小穗数、不育小穗数等性状上与对照存在差异,千粒重和小穗数达到了显著水平。这4个株系都具有抑蚜效果,麦蚜虫口密度抑制率2.3%-48.3%。在转基因株系单分蘖上着生的蚜虫数目明显低于对照。【结论】转基因株系的农艺性状表现正常,外源基因能够稳定遗传和表达,与对照相比,转基因株系具有不同程度的抑制蚜虫效果。

转基因小麦外源基因插入位点初步分析及检测方法的建立

利用染色体步移（genome—walking）原理和巢式PCR方法，对转基因小麦外源基因sGNA插入位点的序列特征进行了分析，并以此建立了sGNA基因转化事件特异性检测的方法。根据sGNA基因的核苷酸序列设计特异引物，利用Takara公司提供的简并随机引物，通过染色体步移法扩增到了转sGNA基因株系zy2—18的插入位点的边界序列，分析得到的边界序列可知，外源基因片段是通过部分同源重组的方式与小麦基因组进行整合的，整合位点位于A染色体组。检测结果显示携带外源基因sGNA的质粒在与小麦基因组整合的过程中发生了剪切，且Ubi启动子与bar基因被切除，保留了两个串联的NOS基因，且在4500～4520bp区间发生了重组后的缺失，而在4786—4810bp区间有一段碱基序列插入，导致插入区段的小麦基因组序列发生重排，初步分析外源基因是通过同源重组的方式进行整合的。通过验证，证明了插入位点信息的准确性，并初步判断插入位点位于小麦A染色体组。因此，随机引物法genome—walking可以作为转基因小麦安全检测及身份识别的有效方法。