枯草芽孢杆菌sacB基因的功能验证及应用

本研究将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组DNA中克隆的1.4 kbsacB基因片段连接到表达载体pET-28a(+),构建了sacB基因表达载体pSacB。通过测定蔗糖水解产生的葡萄糖具有的还原性,确定sacB基因产物具有蔗糖果聚糖酶活性。该基因表达后,导致大肠杆菌(Escherichia coli)细胞不能在含5%蔗糖的培养基中生存。同时发现sacB基因也能赋予耐辐射菌株Deinococcussp.BR501蔗糖敏感性。利用条件致死sacB基因的这一特性,我们分析了D.sp.BR501的突变率,结果表明DNA错配修复缺失突变株(ΔmutS1)的突变频率明显高于野生型。因此枯草芽孢杆菌sacB基因可作为验证DNA损伤修复能力的一种筛选标记。

sacB介导的绿针假单胞菌YL-1遗传操作方法

绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis YL-1是从大豆根围分离获得的,对多种病原细菌和病原真菌有较强抑制作用。为了探明绿针假单胞菌YL-1生防相关基因的功能,本研究以嗜铁素转录调控因子PvdS编码基因为对象,建立了一套基于负选择标记基因sacB的绿针假单胞菌无标记基因敲除技术,构建重组质粒p EX18-pvdS,通过改良的细菌接合转移技术将重组质粒导入野生型菌株YL-1中,利用同源重组技术获得缺失突变株ΔpvdS。生防相关性状研究结果表明,与野生型菌株YL-1相比,突变株ΔpvdS泳动能力和生长能力未发生改变,但是群集运动能力显著下降。同时突变株ΔpvdS合成嗜铁素的能力也显著下降,pvdS基因互补后突变株能恢复合成嗜铁素的功能。本文结果表明,已成功建立了适用于YL-1的基因定向敲除技术和功能基因互补体系,为深入研究YL-1的生防机制奠定了重要基础。

用Tn5-mob-sacB转座子对华癸中生根瘤菌HN3015质粒进行定向标记、消除或缺失

采用Tn5-mob-sacB转座子对Mesorhizobium huakuiiHN3015菌株含有的3条大质粒(pMhHN3015a,150kb;pMhHN3015b,294 kb和pMhHN3015c,390 kb)进行定向标记,获得各个质粒标记菌株。利用sacB基因对蔗糖的敏感性,对标记质粒进行消除实验,获得HN3015质粒消除或缺失的突变株。并对HN3015及其突变菌株的培养特征、生长速度和共生结瘤能力进行了研究,结果表明:质粒消除或缺失的突变株的培养特征和生长速度与出发菌株基本一致,但是,pMhHN3015a与固氮有关,pMhHN3015b消除的菌株则失去结瘤能力,只有pMhHN3015c消除或缺失菌株不影响结瘤与固氮能力。

利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株

为在猪链球菌(S.suis)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据S.suis密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增S.suis中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS)。以相应模板及引物分别经PCR扩增S.suis mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2。采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化S.suis 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株。PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b。将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10%、7.5%、5%和2.5%)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株)。通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7%。通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7%蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选。随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率。各取6个单菌落经PCR及测序鉴定。结果显示,筛选菌株的阳性率在52%~75%。PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFPpbp1b。本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的S.suis GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的S.suis遗传操作及深入研究S.suis相关分子机制奠定了基础。

Sporamin引导肽基因序列与sacB基因融合植物表达载体的构建

枯草杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB)在植物中表达,可以明显提高果聚糖的积累,增强植物的耐寒、耐旱和抗盐碱的能力。本实验采用PCR方法从枯草杆菌基因组中扩增出果聚糖蔗糖转移酶基因(SacB),序列分析结果与Ebskamp公布的编码果聚糖转移酶基因氨基酸序列同源性为100%采用PCR方法从甘薯总DNA中获得sporamin基因的定位于液泡的引导肽序列,序列分析与GenBank上公布的sporamin基因引导肽氨基酸序列同源性为97%。将sporamin引导肽基因序列与sacB基因体外重组,构建了融合植物表达载体pBI-sacB和pBI-sp-sacB,为下一步作物的遗传转化打下了基础。

基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统构建

目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携带colE1复制子和sacB405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacB基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacB基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacB基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacB405a靶位点;sacB基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。

异源果聚糖蔗糖酶在乳酸乳球菌中的分泌表达

为了实现果聚糖蔗糖酶简便有效的纯化,文章将来源于解淀粉芽孢杆菌的基因sacB添加组氨酸标签后与信号肽基因usp45融合形成基因片段usp45-sacB,然后插入质粒pNZ8048中,导入乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000构建重组菌株L.lactis(pNZ8048-usp45-sacB)。通过电泳验证纯化蛋白的分子量为51 kDa,符合预期大小,确定果聚糖蔗糖酶成功表达。为了进一步提高果聚糖蔗糖酶的产量,该研究对诱导时间和诱导剂的质量浓度进行优化,得出最优的表达条件为:诱导时间48 h,诱导剂nisin质量浓度2μg/L。

同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究

构建遗传稳定的多功能农药降解基因工程菌可以为农药污染的生物修复提供良好的菌种资源,然而,构建遗传稳定且不带入外源抗性的基因工程菌是一个难点。通过以受体菌的16SrDNA为同源重组指导序列、sacB基因为双交换正筛选标记构建同源重组载体,二亲结合的方法将甲基对硫磷水解酶基因(mpd)整合到呋喃丹降解菌Sphingomonassp.CDS1染色体的16SrDNA位点,分别成功构建了含1个和2个mpd基因插入到rDNA位点且不带入外源抗性的基因工程菌株CDSmpd和CDS2mpd。同源重组单交换的效率为3.7×10-7～6.8×10-7。通过PCR和Southern杂交的方法验证了同源重组事件。基因工程菌遗传稳定,能同时降解甲基对硫磷和呋喃丹。甲基对硫磷水解酶(MPH)的比活在各生长时期均高于原始出发菌株,比活最高达6.22muμg。

枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因转化小麦的研究

【目的】尝试将枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)导入小麦品种(系)02-371、02-207、郑麦9023和东农7742以提高其耐旱性。【方法】利用农杆菌介导法转化小麦幼胚愈伤组织,将SacB基因导入4个小麦品种,并对转化植株进行PCR和Southern杂交检测。【结果】SacB基因已整合到受体小麦的基因组中。转基因植株整合目的基因的拷贝数多为1～2个。4个受体小麦品种(系)02-371、02-207、郑麦9023和东农7742的转化频率分别为0.88%、1.48%、1.04%和1.23%。RT-PCR检测结果表明,SacB基因在部分转基因植株中得到表达,并使转基因小麦植株的耐干旱胁迫能力明显提高。【结论】向小麦中导入枯草杆菌SacB基因可增强其耐旱性。

布鲁氏菌分子标记、毒力缺失疫苗株△S19-2的构建

通过构建自杀质粒,用定向同源重组的方法,把改造的萤火虫萤光素酶报告基因Luc NF+替换布鲁氏菌S19疫苗株Bp26基因部分片段,构建出布鲁氏菌Bp26基因缺失突变株△S19-1。在此基础上,用同样的方法,敲除△S19-1上的毒力基因Bmp18,构建成△S19-2。用PCR与萤光素酶报告基因在布鲁氏菌中表达的方法进行验证,结果表明Bp26基因与Bmp18基因改造成功,△S19-2具有Bp26基因分子标记、Bmp18毒力基因缺失的特点。

一个可用于鉴定野油菜黄单胞菌正向调控hrpX基因的报告质粒的构建

过敏性反应与致病性基因(hrp)所编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是植物病原细菌的决定性致病因子。在黄单胞菌属中,HrpG是目前已知的hrp基因表达的最高层面的调节蛋白,至今尚未鉴定到野油菜黄单胞菌调控hrpG表达的基因。本研究利用hrpX启动子和蔗糖敏感型sacB基因构建了hrpX表达报告质粒。实验结果表明该报告质粒可用于筛选鉴定正向调控野油菜黄单胞菌hrpX表达的基因。该报告质粒的构建,为研究hrp基因表达调控机制,揭示植物病原细菌的致病机制提供了有效的材料。

中慢生华癸根瘤菌nodD-突变株的筛选及其对紫云英的促生作用

通过二亲接合的方式,将含有sacB基因和nodD基因部分片段的质粒与中慢生华癸根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)93(Mh93)菌株进行同源重组,在含10%蔗糖的TY平板上成功地筛选到了nodD基因突变株Mh93-27。利用温室盆栽试验研究了紫云英单作及紫云英-小麦间作体系Mh93-27对紫云英的促生作用,结果表明,接种Mh93-27后,紫云英的地上部生物量和全氮含量以及根部生长得到了不同程度的提高,但只有在小麦孕穗期和收获期时,根瘤菌才表现出显著的促生作用。

华癸中生根瘤菌共生质粒的定向标记、消除与结瘤功能的鉴定

采用Tn5-mob-sacB转座子对华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)菌株7653R的共生质粒进行定向标记,获得该质粒标记菌株7653RT14。利用sacB基因对蔗糖的敏感性,对标记质粒进行消除实验,获得7653R的共生质粒消除突变株7653R-1。测得Tn5-mob-sacB转座频率高于10?5。突变株的培养特征与出发菌株基本一致。采用琼脂管法对7653RT14和7653R-1进行回接实验,结果显示7653RT14能正常结瘤固氮,表明Tn5的插入并未影响其共生能力,但失去共生质粒的7653R-1则为不结瘤或只结个别小瘤。稳定性实验结果表明供试菌株的标记质粒在本实验条件下是稳定的,可以作为共生质粒转移的供体菌。

转基因杨树对沙地土壤微生物类群的影响

本试验采用传统的土壤稀释涂布平板法研究了转SacB、Vgb及JERFs36基因杨树对土壤微生物中主要类群细菌、丝状真菌及放线菌数量的影响。结果表明,转JERFs36基因杨树的土壤微生物总量平均为干土18.73×106cfu/g,转Vgb基因杨树为干土4.36×106cfu/g,转SacB基因杨树为干土242.28×106cfu/g。3种转基因杨树土壤根际主要微生物类群数量存在差异,但均未达到统计学显著水平,即3种转基因杨树对其根际土壤微生物主要类群的数量没有显著影响。

转座因子IS10一个新的插入靶位点的序列分析(英文)

转座因子在生物体内广泛存在,它在研究基因的重组机理以及生物染色体的进化方面有着重要意义。IS10是细菌中的一种转座因子,它既能单独作为插入序列,也能作为Tn10的一部分进行转座。利用含sacB基因的质粒pXT3sacB,获得了由转座因子IS10插入而导致sacB基因失活的突变体。通过对插入突变体质粒DNA的序列测定(GenBank登记号为AY580883.1),结果表明IS10两端分别包括22bp倒置重复区CTGAGAGATCCCCTCATAATTT和AAATCATT-AGGGGATTCATCAG,这与前人的报道一致;而IS10两端的插入靶位点序列为TGCTTGGTT,该9bp靶位点序列与前人报道的序列NGCTNAGCN不同。根据文献资料,本研究中的靶位点序列是首次报道。此外,通过Southernblot杂交分析,插入sacB基因中的IS10来源于宿主大肠杆菌DH5α染色体DNA,并且IS10在DH5α染色体中为两个拷贝。此外,本研究利用sacB基因捕获到转座因子IS10,该方法为研究其他插入序列提供了一个有益的体系。

特利波契巴尔通体基因敲除体系的建立

本研究旨在建立基于同源重组技术的特利波契巴尔通体基因敲除方法。研究通过扩增并融合Ⅳ型分泌系统VirB4基因的上下游同源片段,将同源片段与pJM05质粒进行体外拼接,并将pJM05-ΔVirB4质粒转化进入S17-1大肠杆菌中;通过双亲接合转移将大肠杆菌S17-1中的pJM05-ΔVirB4质粒转移到特利波契巴尔通体中进行同源臂交换,产生单交换菌株;随后利用质粒中sacB基因表达产物分解蔗糖对自身产生毒性作用,在蔗糖平板中筛选出22个双交换菌株,通过菌落PCR及测序验证,共确定出6个VirB4基因框内缺失菌株;并且测序结果表明这6个菌株在VirB4基因框内缺失了2 136 bp。

少根根霉脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

利用PCR技术从少根根霉基因组中扩增出脂肪酶成熟肽基因ral,并从枯草芽孢杆菌基因组中扩增出sacB基因的启动子-信号序列(SacB);通过搭桥PCR将SacB序列与ral基因融合,并将该基因表达盒连接到枯草杆菌分泌表达载体pGJ103中构建了脂肪酶基因的诱导表达载体pGJ103-SacB-ral。将重组载体转化至枯草芽孢杆菌后,少根根霉脂肪酶成熟肽基因在SacB启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,产物分泌至胞外。

果聚糖蔗糖转移酶基因的克隆及耐盐转基因烟草的培育

采用ＰＣＲ方法克隆了枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）果聚糖蔗糖转移酶基因（ＳａｃＢ），将其与克隆自酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）的羧肽酶Ａ的液泡引导信号序列连接得到嵌合基因。测序验证后，插入含ＮＰＴⅡ基因的植物双元表达载体ｐＢｉｎ４３８中，经农杆菌介导转化烟草。部分经卡那霉素筛选的抗性芽能在含１％ＮａＣｌ的ＭＳ培养基上正常生根，而未转化芽不能生根或根生长缓慢。转基因小苗移入盛蛭石的花盆并浇灌含１％ＮａＣｌ的ｈｏａｇｌａｎｄ′ｓ营养液，１７ｄ后，其中一些转基因烟草植株生长良好，而未转化苗出现明显萎蔫。ＰＣＲ扩增及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析证实ＳａｃＢ基因已导入转基因植株并得到转录。此结果表明ＳａｃＢ基因的植物基因工程可提高烟草植株的耐盐性。

“颅底七穴”针法治疗帕金森病114例临床观察

目的:评价"颅底七穴"针法治疗帕金森病的临床疗效。方法:入选病例随机分为针刺治疗组(针刺组)与西药对照组(西药组),针刺组应用"颅底七穴"针法隔日治疗,西药组采用美多芭口服250mg tid。2组同期治疗9周,随访半年,期间5次应用改良Webster评分记录其症状变化,随访结束后进行疗效评价。结果:治疗前2组改良Webster得分均值分别为15.77±3.575和14.58±4.050;经针灸或西药治疗3个疗程后,2组改良Webster分别降低为6.70±3.805和7.94±4.605。疗效判断分析结果:针刺组为17.00～94.7%,平均57.23%;西药组为5.80～100%,平均47.51%。针刺组对PD轻中度患者的治疗总有效率为86.89%,而西药组总有效率为75.47%,2组比较差异有统计学意义(P=0.019)。随访后改良Webster评分分别为6.70和8.23。结论:"颅底七穴"针法可以改善帕金森病患者的临床症状,其临床疗效优于常规西药的应用;对于改善帕金森病患者的肢体灵活性,改善患者僵直、俯屈姿态以及面容的呆板、言语障碍优于常规左旋多巴类药物的应用,且其治疗远期疗效更佳。

单次收肌管阻滞联合患者自控静脉镇痛在全膝关节置换术术后镇痛的效果观察

目的探讨单次收肌管阻滞(single shot adductor canal blockade,SACB)联合患者自控静脉镇痛(patient controlled intravenous analgesia,PCIA)和连续收肌管阻滞(continuous adductor canal blockade,CACB)在全膝关节置换术(total knee arthroplasty,TKA)术后镇痛中的效果和不良反应。方法收集2018年1月至2019年12月首都医科大学宣武医院行TKA的患者的临床资料,筛选SACB联合PCIA组(A组)46例,CACB组(B组)43例。观察患者术后24 h(T1)、48 h(T2)的生命体征,包括HR、MAP、呼吸频率(respiratory rate,RR)、体温(temperature,T)、静息和运动状态数字评价量表(numerical rating scale,NRS)疼痛评分、镇静评分、活动情况评分、Bromage评分、不良事件等。结果T1、T2时两组生命体征和静息、运动状态NRS疼痛评分的差异无统计学意义(P>0.05)。两组术后镇静评分、术后恶心呕吐、皮肤瘙痒、尿潴留、补救镇痛、排气延迟的差异无统计学意义(P>0.05)。与B组相比,T1、T2时A组活动状态评分更低[(1.52±0.43)分比(1.83±0.51)分,P<0.05;(1.14±0.43)分比(1.22±0.40)分,P<0.05]。T1时Bromage评分更低[(1.02±0.32)分比(1.22±0.44)分,P<0.05]。T2时两组Bromage评分差异无统计学意义(P>0.05)。结论在TKA术后镇痛中,相对于CACB,SACB联合PCIA不仅可获得满意的术后镇痛,在Bromage评分和早期下地活动中更具优势,并且不增加不良反应发生率。