禽白血病病毒p27抗原ELISA检测试剂盒的比较与评估

为了更好地进行禽白血病监测与净化,研究使用由蛋清、细胞培养物、胎粪等多种样品组成的样品盘对7种禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)p27抗原ELISA检测试剂盒(国产试剂盒DA、DB、DC,进口试剂盒IA、IB、IC、IDEXX)进行比较。结果显示:从分析特性上看,试剂盒分析特异性均较好,未观察到与其他常见禽源病毒的交叉反应;与IDEXX相比,DA、IA的分析敏感性较高,DB、IC其次,DC、IB较低,对于ALV不同亚群,各种试剂盒分析敏感性差异可达2~3个稀释度;从诊断特性上看,与IDEXX相比,DB、DC和IC的诊断敏感性和诊断特异性均高于90%;DA、IA和IB与IDEXX的诊断敏感性和诊断特异性均高于80%;各试剂盒对于不同类型样品(DF-1细胞培养物、蛋清、胎粪)的诊断敏感性和诊断特异性存在差异;从重复性上看,DA和IA的批内变异系数均在15%以内。综上所述,与IDEXX相比,当前国产p27抗原ELISA检测试剂盒DA和DB、进口p27抗原ELISA检测试剂盒IA和IC的各项性能可满足禽白血病净化各阶段对不同类型样品的检测需求。

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。

抗PCV4 Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可应用于猪圆环病毒4型(PCV4)候选疫苗特异性抗体检测与评价方法,本研究应用PCV4 Cap蛋白作为抗原,以PCV4多克隆兔源抗体作为一抗,优化各反应的最佳条件并建立了针对PCV4 Cap蛋白抗体的间接ELISA方法。最佳条件为2μg/m L PCV4 Cap纯化蛋白,4℃包被过夜,5%脱脂乳封闭60 min,待检血清稀释比例为1∶800,反应条件为37℃、45 min,酶标抗体稀释比例为1∶5000,反应条件为37℃、60 min,底物显色时间为10 min,Cut of f值为0.157,灵敏度可达102400倍。成功建立的抗PCV4Cap蛋白抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、重复性和特异性。可为检测PCV4候选疫苗的特异性抗体水平提供一种精准、高效的方法。

牛病毒性腹泻病毒E^(rns)-ELISA抗体检测试剂盒的制备

为建立快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的血清学方法,本试验以BVDV NADL毒株结构蛋白E^(rns)作为包被抗原,优化反应条件并组装BVDV酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体检测试剂盒,通过重复性试验、灵敏性试验、符合率试验和保存期试验验证该试剂盒的准确性、灵敏性和稳定性。结果显示,抗原包被浓度为4μg/mL,1%酪蛋白溶液37℃封闭45 min,被检血清以1∶400稀释孵育30 min,兔抗牛HRP标记二抗以1∶20000稀释孵育30 min,TMB底物反应5 min时,ELISA的反应背景下降,区分度最好。优化后方法的批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数均在10%以内,表明该试剂盒具有较好的稳定性;灵敏性试验结果显示,当阳性血清稀释度达到1∶6400时仍可以检测为阳性,说明该试剂盒灵敏度较高;该试剂盒与美国爱德士生物科技公司(IDEXX)BVDV总抗体检测试剂盒共同检测466份临床血清样品,两者总符合率为89.1%;保存期试验结果显示,第4个月时该试剂盒仍能检测到阳性血清,说明稳定性较好。综上表明,本试验利用E^(rns)蛋白建立的BVDV间接ELISA抗体检测试剂盒灵敏度高且重复性好,可为BVDV抗体检测和流行性调查提供新的方法。

可变色ELISA样品稀释液制备及其性能检测

为解决酶联免疫吸附法(ELISA)检测过程中样品错加、漏检问题,研制开发了一种可变色ELISA试剂盒样品稀释指示剂,明确了其制备方法,并开展了性能检测评价及其在检测过程的应用特性。可变色稀释指示剂制备方法为:在0.01 mol/L PBS(pH=7.2)基础缓冲液中,加入血清蛋白组分、0.01%可变色指示剂和特效稳定剂,充分溶解后再添加Krovin750防腐剂,定容后即可。结果:制备的可变色ELISA样品稀释显色反应明显,可用于ELISA试剂盒检测中的血清或血浆样本稀释,有效避免检测过程样品跳孔和错加现象;同时对样品具有良好保护,显著提高了检测结果的准确性和稳定性,实现了对样品的有效保护,降低了样品基质背景干扰,提高了检测结果的准确性和稳定性。

基于Penton蛋白禽腺病毒血清4型间接ELISA抗体检测方法的建立

Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,Penton蛋白最佳包被质量浓度为2μg/mL,血清稀释倍数为200倍,酶标抗体稀释倍数为1∶5000,阳性临界值为0.222,敏感性可达到1∶6400,与鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均无交叉反应,特异性良好,批间批内重复性变异系数均<10%,在100份临床血清中阳性检出率为77%,与商品化试剂盒检出符合率可达98%。综上,建立的ELISA抗体检测方法可以用于禽腺病毒4型临床抗体检测。

PBL-Sandwich混合教学模式在临床分子生物学检验技术实习教学中的应用

目的 探讨以问题为基础的教学法(PBL)-Sandwich混合教学模式在临床分子生物学检验技术实习教学中的应用效果。方法 选取2018-2019年进入该院分子生物学实验室实习的82例实习生作为研究对象。以2018年的42例实习生作为对照组,采用传统教学模式;以2019年的40例实习生作为试验组,采用PBL-Sandwich混合教学模式。实习结束后,采用理论考试、操作考核和问卷调查等形式评价实习生的教学效果。结果 试验组的理论考试成绩与操作考核成绩均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。共发放调查问卷82份,回收有效问卷80份,其中试验组39份,对照组41份,有效回收率为97.56%(80/82)。试验组在提高学习主动性、激发学习兴趣、增强师生间的交流和互动、提升分析解决临床实际问题能力和教学方法实施满意度方面均优于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PBL-Sandwich混合教学模式能有效激发实习生学习兴趣,培养实习生自主学习的主观能动性,提高分析、解决临床实际问题能力,教学质量得到提升。

案例教学法联合Sandwich教学法在老年科教学中的应用

目的探讨案例教学法联合Sandwich教学法在老年科教学中的应用效果。方法选取2022年3月—2023年6月潍坊医学院附属医院的60名参加老年科教学的学生为研究对象,按照随机数表法分为两组,各30名。对照组行常规教学,观察组行案例教学法联合Sandwich教学法教学,比较两组教学效果。结果观察组各项模拟出科考试成绩高于对照组,差异有统计学意义(P均<0.05);观察组对实习教学效果的各项满意度评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论案例教学法联合Sandwich教学法可提升老年科教学的效果,并提高学生对实习教学效果的满意度。

Sandwich联合角色扮演教学法在住培医师医患沟通能力培训中的应用

目的 以腰椎穿刺术前谈话为例,探讨Sandwich联合角色扮演教学法在住院医师规范化培训(住培)学员医患沟通能力培训中的应用价值。方法 选取2019年3月至2023年1月在该院神经外科进行住培的40名学员,将其分为A、B组,每组20名。A组通过传统教学方法进行腰椎穿刺术前谈话的教学,B组运用Sandwich联合角色扮演教学法进行教学,在教学前、中、后期分别使用医患沟通技能评价量表对2组学员进行考评,最后对2组学员进行满意度问卷调查,对比2组教学效果及学员对教学的满意度。结果 2组学员在教学前测评得分均较低,在教学后测评较教学前均有提升,差异均有统计学意义(P<0.05);与A组比较,B组在教学中期测评得分明显更高,差异有统计学意义(P<0.05);2组在教学后期测评得分比较,差异无统计学意义(P>0.05)。B组住培学员的满意度高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Sandwich联合角色扮演教学法能快速提升学员的术前谈话沟通能力,也能提高学员的教学满意度,适合在相关教学活动中推广。

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

[目的]制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。[方法]利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。[结果]重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂乳+5%BSA,血清样品和二抗孵育时间均为90 min, TMB底物反应时间为10 min,临界值为0.182。建立的间接ELISA方法与常见的猪病毒阳性血清不反应,与IFA符合率达94.0%。[结论]原核表达系统表达的VP2蛋白具有良好的免疫原性,制备的多克隆抗体能与SVA和VP2发生特异性反应。建立的间接ELISA方法特异性高,与IFA符合率高,适用于临床SVA抗体检测和疫苗效力评价。

猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

MDT+Sandwich教学法在本科内科学教学中的应用

目的探讨多学科诊疗(MDT)+“三明治”教学法(Sandwich教学法)与传统的以学科为基础的教学法在本科内科学教学中的应用效果。方法选取五年制临床医学专业60名本科生为研究对象,随机分为对照组(n=30)和试验组(n=30)。对照组采用传统的以学科为基础的教学法,试验组采用MDT+Sandwich教学法,课程结束后比较两组教学效果。结果试验组理论考试、临床技能操作考核成绩及课堂教学效果均优于对照组。结论在内科学教学中引入MDT+Sandwich教学法,能够更好地培养学生分析和解决临床问题能力。

检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

为建立快速检测H6亚型禽流感病毒的血清学方法,试验利用前期制备的两株抗H6亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体,建立检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法,并进行特异性、灵敏度、稳定性试验以及对活禽市场采集的48份咽拭子样品的检测效果。结果显示:该ELISA方法只与H6亚型禽流感病毒反应,而与H1、H3、H4、H5、H7、H9、H10、H12等其他亚型禽流感病毒,血清4型禽腺病毒、血清8b型禽腺病毒、血清3型鸭腺病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、鹅星状病毒、小鹅瘟病毒、传染性法氏囊病病毒以及禽白血病病毒均无交叉反应;该ELSIA方法可检测2.32×10^(4)TCID50/mLH6亚型禽流感病毒,批间和批内重复试验变异系数均小于10%;该ELISA方法和RT-PCR方法对活禽市场采集的48份咽拭子样品检测结果一致,进一步检测攻毒鸡的咽拭子显示该方法可有效检测咽拭子中H6亚型禽流感病毒。研究表明,基于两株单克隆抗体建立的检测H6亚型禽流感病毒的双抗体夹心ELISA方法具有特异性强、灵敏度高的特点,适用于H6亚型禽流感病毒感染的临床检测。

Sandwich教学法融入思政教育在超声诊断学中的应用

研究Sandwich教学法融入思政教育模式在超声诊断学教学中应用效果。方法 选择2022年11月-2023年11月在本院接受超声诊断学教学的学生40名,随机分组法分作试验组(Sandwich教学法融入思政教育模式)和对照组(传统教学模式),每组20名,分析不同教学模式的实施效果评价。结果 出科时,试验组考核成绩明显高于对照组,P<0.05;试验组综合能力和批判性思维能力均优于对照组,P<0.05。结论 超声诊断学教学中实施Sandwich教学法融入思政教育模式,可明显提升学生考核成绩、综合素质以及批判性思维能力,可以应用于超声诊断学教学。

鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。

猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立

旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。

竞争ELISA和间接ELISA方法应用于牛布鲁氏菌病净化的研究

旨在评价竞争ELISA方法和间接ELISA方法联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA)抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA(iELISA)抗体检测试剂盒及微量法补体结合试验(mCFT),对西北某牛场3 271份牛血清进行检测。本研究采用cELISA初筛、iELISA确诊的净化策略,对检测阳性牛进行淘汰,可疑牛和阴性牛在完全消毒后隔离饲养,并在前一次检测后每隔1个月重新对群体采样,进行多次连续的“检—淘”策略,在群体的个体阳性率低于2%或全部转阴后使用微量补体结合试验(mCFT)进行验证。并在群体全部转阴后继续检测2个月后确定净化结果。结果显示,首次检测阳性率35.36%的感染群体实施本净化策略后,在第1个月阳性率下降至25.41%,第2个月下降至7.16%,第3个月下降为1.86%,到第4个月则实现了布病阳性群体的全面转阴,mCFT验证个体阴性率100%。此后持续检测2个月,个体阳性率均为0,至此实现了感染群体的布病净化,使得群体内近一半的牛免于扑杀,大大减少了经济损失。综上发现,将cELISA用于布病初筛,iELISA用于布病确诊的联合使用,经多次连续检测并结合常规的隔离消毒措施,可以在短时间内实现对于布病感染群体的全面净化。

罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白的表达及IgM抗体间接ELISA方法的建立

为了建立一种具有良好特异性、敏感性、重复性和准确性的,能够检测罗非鱼源无乳链球菌的ELISA方法,试验首先进行了罗非鱼源无乳链球菌ScpB基因的克隆及其蛋白的表达和纯化,然后以重组蛋白作为包被抗原、罗非鱼待测血清作为一抗、抗罗非鱼IgM单克隆抗体2C10作为二抗、羊抗鼠IgG-HRP作为三抗建立间接ELISA方法并对该方法进行条件(抗原包被质量浓度、一抗稀释度、抗原包被条件、封闭液、一抗作用时间、二抗作用时间)优化,最后确定该方法的临界值并进行特异性、敏感性、重复性和符合性试验。结果表明:纯化后的罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白大小为104.6 ku,与预期大小一致,可被罗非鱼IgM抗体特异性识别;建立的IgM抗体间接ELISA方法的最佳抗原包被质量浓度为0.1μg/mL,最佳一抗稀释度为1∶5,最佳抗原包被条件为4℃、12 h,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳一抗作用时间为2 h,最佳二抗作用时间为0.5 h;临界值上限为0.456,临界值下限为0.377;批内变异系数为3.349%~5.272%,批间变异系数为2.793%~5.902%,均低于10.000%;仅可检测出罗非鱼无乳链球菌阳性血清和罗非鱼ScpB蛋白免疫血清,无法检测出罗非鱼嗜水气单胞菌阳性血清、罗非鱼荧光假单胞菌阳性血清、罗非鱼海豚链球菌阳性血清和罗非鱼鳗弧菌阳性血清;待测血清最大稀释度为1∶640;与无乳链球菌全菌包被ELISA检测方法比较,阳性率略低,符合率为83.43%。说明本研究建立的罗非鱼源无乳链球菌IgM抗体间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性。

猪胞内劳森菌抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

猪增生性肠病(PPE),通常被称为猪回肠炎(PI),由胞内劳森氏菌(LI)感染引起。为建立检测LI抗体的间接ELISA方法,本研究构建LI外膜蛋白基因(LI0841)的重组表达质粒p ET28a-LI0841,经测序无误后转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测重组蛋白LI0841蛋白(rLI0841)的表达形式,经Ni柱纯化后采用western blot鉴定其反应原性。SDS-PAGE结果显示,在32 ku处出现目的条带,且其主要以可溶性形式表达;western blot结果显示,r LI0841能够与兔LI多克隆抗体特异性反应,表明纯化的r LI0841具有较强的反应原性,可作为包被抗原用于建立间接ELISA检测方法,经各反应条件优化初步建立LI抗体的间接ELISA检测方法。各反应条件的优化结果显示,4.38 ng/孔的r LI0841以4℃过夜包被最佳;血清最佳稀释度为1∶100,37℃反应0.5 h;羊抗猪Ig G-HRP最佳稀释度为1∶10000,37℃作用0.5 h;TMB底物37℃显色15 min。利用建立的间接ELISA方法检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌及经美国Biostone PPE抗体检测试剂盒检测为阳性的猪血清,评估该方法的特异性;将LI阳性血清2倍倍比稀释(1∶100~1∶51200)后,采用本研究建立的间接ELISA方法检测,评估该方法的敏感性;以同一批次和不同批次包被的酶标板分别检测5份不同LI抗体水平的猪血清,评估该方法的重复性。结果显示,该方法除能检测到LI阳性血清外,其余相关病原的阳性血清均为阴性,特异性较强;LI阳性血清1∶800稀释时检测结果仍为阳性,敏感性较高;对5份不同抗体水平的LI阳性血清的批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,重复性较好。利用该ELISA方法与美国Biostone公司PPE抗体检测试剂盒同时检测104份临床猪血清样品,比较二者的检测结果,并计算二者的符合率;采用建立的间接ELISA方法检测黑龙江、吉林等地区413份临床猪血清样品,分析LI在上述地区的流行状况。结果显示,两种方法的阳性符合率为90.91%,阴性符合率为91.84%,总符合率为91.35%;413份临床猪血清样品中LI的阳性检出率为59.81%(247/413),表明LI在黑龙江、吉林等地区的猪群中普遍存在。本研究建立了检测LI抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性与准确性均较好,为临床PI血清流行病学调查提供技术支持。

PCV4 Cap抗体ELISA检测方法的建立及血清流行病学调查

旨在建立一种猪圆环病毒4(porcine circovirus type 4, PCV4)Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法,对猪群中PCV4抗体进行检测,并与以往的关于PCV4血清流行病学的调查结果进行对比研究,从而更全面地了解PCV4在猪群中的感染和流行情况。本研究利用原核表达系统成功表达PCV4 Cap蛋白,对反应条件进行优化,建立了基于PCV4 Cap蛋白的间接ELISA方法。采用建立的ELISA方法对中国18个省份的不同阶段的2 298份猪血清样本进行检测,以调查中国猪群中PCV4的血清学流行情况。同时将Cap-ELISA检测方法与之前建立的Rep-ELISA进行对比,平行检测845份血清样本。结果显示,在18个省份中,17个省的血清样本中检测到PCV4抗体。PCV4总血清阳性率为34.94%,母猪和育肥猪阳性率分别为59.95%和31.64%,仔猪阳性率为21.14%,保育猪中检出的阳性率最低,为4.20%。两种方法共同检测845份血清样本,符合率为82.84%,其中Cap-ELISA检测总阳性率为31.83%,Rep-ELISA检测总阳性率为35.03%。研究表明,PCV4在中国广泛传播,不同年龄阶段的猪只均能感染。Cap-ELISA和Rep-ELISA两种方法一致性高,从抗体消长规律来分析,两种方法都说明猪群感染PCV4主要在育肥猪和母猪阶段。本研究提供了中国PCV4的最新血清流行病学特征和PCV4在不同阶段猪群中的感染情况,进一步证实了PCV4在我国猪群中有一定的感染率,其危害值得进一步研究和关注。