Expression of Candida Albicans Secreted Aspartyl Proteinase in Acute Vaginal Candidiasis

In order to analyze the in vivo expression of Candida albicans secreted aspartyl pro- teinases (SAP) in human vaginal infection, the vaginal secretion from 29 human subjects was col- lected by vaginal swab, and the expression of SAP1–SAP6 was detected by reverse-transcriptase po- lymerase chain reaction using specific primer sets. It was found that Sap2 and Sap5 were the most common genes expressed during infection; Sap3 and Sap4 were detected in all subjects and all 6 SAP genes were simultaneously expressed in some patients with vaginal candidiasis. It was suggested that the SAP family is expressed by Candida albicans during infection in human and that Candida albi- cans infection is associated with the differential expression of individual SAP genes which may be involved in the pathogenesis of vaginal candidiasis.

白念珠菌天冬氨酸蛋白酶基因SAP2在大肠杆菌中的表达及产物纯化

目的构建SAP 2重组原核表达载体并表达、纯化出可溶性的蛋白,为抗体制备及Sap2抗原检测奠定基础。方法提取白念珠菌基因组DNA为模板,经PCR方法获取SAP 2目的基因。双酶切SAP 2基因与原核表达载体pMAL-c2x(+),连接酶切产物,转化大肠杆菌TOP10感受态细菌,筛选菌落和测序鉴定。将pMAL-c2x/SAP2重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达出可溶性的融合蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析、蛋白酶Factor Xa切割标签获得纯化的Sap2蛋白。结果经PCR扩增获得正确的SAP 2序列并定向插入原核表达载体pMAL-c2x(+)中。重组原核表达载体pMAL-c2x/SAP2经IPTG诱导14 h后表达出可溶性的融合蛋白,并经纯化、切除标签后得到目的蛋白。结论成功构建了白念珠菌天冬氨酸蛋白酶原核表达质粒pMAL-c2x/SAP2,该质粒在BL21(DE3)中可获得高效融合表达,通过亲和层析纯化及标签切割得到了氨基酸序列同天然蛋白一致的目的蛋白。

口腔白念珠菌3种致病相关分泌型水解酶检测方法的建立及应用

目的了解口腔白念珠菌3种致病相关分泌型水解酶的体外表达水平。方法分别采用牛血清白蛋白平板、卵黄琼脂平板和三丁酸甘油酯平板检测88株临床分离的口腔白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)、磷脂酶(PL)和脂肪酶(Lip)的活性。结果 88株白念珠菌中有70株(79.5%)高表达SAP,有64株(72.7%)高表达PL,仅有1株(1.2%)高表达Lip,有67株(76.1%)中等表达Lip。SAP和PL的表达呈正相关(r=0.221,P<0.05),Lip与SAP、PL均无相关性(r值分别为0.085、0.109,P值分别为0.432、0.311)。结论大部分口腔白念珠菌高表达SAP和PL,中等表达Lip。分泌型水解酶是口腔白念珠菌最主要的毒力因子之一。

白色念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶在口腔扁平苔藓患者唾液中的表达

研究白色念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)家族在扁平苔藓患者唾液中的表达,进而探讨白色念珠菌病与扁平苔藓的关系。选取白色念珠菌携带者、白色念珠菌病患者、携带白色念珠菌的扁平苔藓患者、伴有白色念珠菌病的扁平苔藓患者各20例,念珠菌培养阴性的扁平苔藓患者10例。从唾液标本中直接提取RNA,进行RT-PCR。白色念珠菌携带者唾液中有SAP2、SAP4-6、SAP7的不同表达,携带白色念珠菌的口腔扁平苔藓患者唾液中有SAP2、SAP4-6、SAP7、SAP8、SAP9的不同表达,所有携带者中均未表现SAP1、SAP3和SAP10的阳性扩增。白色念珠菌患病者及伴有白色念珠菌病的口腔扁平苔藓患者唾液中有SAP1-10的不同表达。念珠菌培养阴性的扁平苔藓患者均无SAP1-10的阳性扩增。SAP9与扁平苔藓密切相关。

白念珠菌致病相关的水解酶

白念珠菌是一种重要的人类致病性真菌,其致病机制与多种因素有关。水解酶是白念珠菌最重要的毒力因子之一,在其入侵宿主过程中起关键作用。白念珠菌水解酶包括分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶和脂肪酶,介导白念珠菌的表型转换、对宿主组织的黏附及对宿主免疫系统的干预,使其能够入侵宿主组织和逃避宿主的免疫防御机制。该文我们综述了白念珠菌水解酶的生物学属性和致病机制的研究进展。

白念珠菌的毒力及其对氟康唑耐药性的相关性研究

目的:研究白念珠菌的毒力因子分泌性蛋白酶(SAP)活力与其对氟康唑耐药性形成之间的关系。方法:(1)将对氟康唑敏感的白念珠菌,培养在含氟康唑浓度逐渐增加的液体培养基中,体外诱导为氟康唑耐药株;(2)运用牛血清白蛋白培养基方法,分别测定了对氟康唑敏感和对氟康唑耐药的白念珠菌的分泌性蛋白酶活力。结果:(1)40株对氟康唑敏感的白念珠菌均在体外被成功地诱导为对氟康唑的耐药株;(2)耐药株的分泌性蛋白酶活力明显强于敏感株(P<0.001)。结论:白念珠菌的毒力因子分泌性蛋白酶活力增加与其对氟康唑耐药性的增加相一致。

分泌型天冬氨酸蛋白酶-2的研究进展

分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)-2是真菌生存所需的毒力因子,可以诱导抗体产生,参与白色假丝酵母菌的多方面致病过程。本文就Sap-2的命名、结构、生物化学特性、表达、影响因子、致病机制和应用等研究进展作一综述。

白念珠菌分泌性蛋白酶活力与其对氟康唑耐药性之间关系的研究

目的研究白念珠菌分泌性蛋白酶(Sap)活力与其对氟康唑耐药性之间的关系。方法将对氟康唑敏感的白念珠菌培养在含氟康唑浓度逐渐增加的液体培养基中,体外诱导为氟康唑耐药株;运用牛血清白蛋白培养基(BSA)的方法测定了对氟康唑敏感的白念珠菌和对氟康唑耐药的白念珠菌的分泌性蛋白酶活力。结果40株对氟康唑敏感的白念珠菌均在体外被成功的诱导成为对氟康唑耐药的耐药株。耐药株的分泌性蛋白酶活力明显强于敏感株(P<0.001)。结论白念珠菌Sap活力的增加与其对氟康唑耐药性增加是一致的。

不同来源白念珠菌感染小鼠前后胞外水解酶活力差异

目的了解白念珠菌进入小鼠宿主前后其分泌胞外水解酶能力是否改变。方法挑选分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶活力无差异的艾滋病、外阴阴道念珠病病患来源和健康人来源白念珠菌,尾静脉注射感染小鼠,分离发病死亡小鼠肾脏菌株,比较感染小鼠前后菌株胞外水解酶活力差异。结果不同来源菌株感染的小鼠28d内死亡速率差异显著(χ2=82.5,P<0.05),从高到低依次为艾滋病、外阴阴道念珠病、健康人来源组;各来源菌株感染小鼠后肾脏分离株分泌型天冬氨酸蛋白酶表达水平皆高于感染小鼠前(F=7.89,P<0.05),不同来源区别显著(F=4.96,P<0.05),从高到低依次为艾滋病、外阴阴道念珠病、健康人来源;感染小鼠前均未曾测得磷脂酶活力的各来源菌株中,在感染小鼠后仅艾滋病、外阴阴道念珠病来源组小鼠肾脏分离株可测得磷脂酶活力,但艾滋病、外阴阴道念珠病来源两组间感染小鼠后肾脏分离株磷脂酶活力无显著差异(F=2.54,P>0.05);各来源白念珠菌感染小鼠前后均未测得脂肪酶活力。结论在宿主体内白念珠菌表达天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶能力相较于体外有增强;在不同宿主环境状态下,白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶和磷脂酶的潜在表达能力有差异,即宿主免疫状态越弱时,白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶潜在表达能力越强。

SAP2 mRNA表达在白色假丝酵母菌二相性中的研究

目的通过对编码白色假丝酵母菌分泌型天冬氨酸蛋白酶2(SAP2)基因在该菌酵母相和菌丝相中的mRNA表达水平的比较,从分子生物学角度探讨编码白色假丝酵母菌侵袭性酶的重要毒力基因在白色假丝酵母菌二相性中的表达差异。方法采用RNAiso Plus试剂联合玻璃珠破壁方法,分别提取白色假丝酵母菌的酵母相和菌丝相的总RNA;应用半定量RT-PCR技术,比较SAP2基因在白色假丝酵母菌酵母相和菌丝相中mRNA水平的表达差异。结果提取的白色假丝酵母菌酵母相及菌丝相总RNA电泳结果均可见较为清晰的28S、18S、5S3个条带;运用半定量RT-PCR技术,得出SAP2基因在酵母相和菌丝相内mRNA的相对表达量分别为0.789±0.039,0.927±0.062,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用RNAiso Plus试剂联合玻璃珠破壁方法提取的白色假丝酵母菌酵母相和菌丝相总RNA的浓度和纯度较高、完整性好;SAP2基因在白色假丝酵母菌菌丝相mRNA表达水平明显高于酵母相。

接受化疗的恶性肿瘤患者口腔念珠菌分离株的毒力研究

目的研究接受化疗的恶性肿瘤患者口腔念珠菌分离株的细胞外磷脂酶活性、分泌型酸性蛋白酶活性及溶血活性。方法采用含漱法收集258例恶性肿瘤患者的漱口液标本,运用念珠菌分离鉴定方法,了解接受化疗的恶性肿瘤患者口腔念珠菌的检出及分布情况;并将分离鉴定的念珠菌分别接种在蛋黄培养基、BSA-琼脂培养基及羊血琼脂培养基,检测这些口腔分离株的胞外磷脂酶活性、蛋白酶活性以及溶血活性。结果接受化疗的恶性肿瘤患者口腔念珠菌检出率为38.4%。99株分离鉴定的念珠菌中,白色念珠菌67株,近平滑念珠菌16株,热带念珠菌5株,克柔念珠菌5株,光滑念珠菌3株,葡萄牙念珠菌3株。在99株念珠菌中细胞外磷脂酶、分泌型酸性蛋白酶及溶血性,检出率分别为74.7%、87.9%、86.9%。这三种毒力因子在白色念珠菌中的检出率分别为92.5%、100%、98.5%,在非白色念珠菌中分别为37.5%、62.5%、62.5%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.001)。在67株白色念珠菌分离株中,92.5%的菌株同时产生了蛋白酶和磷脂酶,且半数以上为蛋白酶高活力。在非白色念珠菌中,62.5%(10/16)的近平滑念珠菌检出磷脂酶、蛋白酶、溶血性,具有最高的检出率;而5株克柔念珠菌均未产生胞外磷脂酶、蛋白酶、溶血性。白色念珠菌与非白色念珠菌的毒力因子比较中,白色念珠菌的磷脂酶活性(PZ=0.74±0.12)、蛋白酶活性(PA=0.37±0.33)、溶血指数(HI=0.36±0.10)明显高于非白色念珠菌(PZ=0.92±0.13、PA=0.73±0.24、HI=0.65±0.29)(P<0.001)。结论细胞外磷脂酶、分泌型酸性蛋白酶、溶血性是白色念珠菌的重要毒力因子。在接受化疗的恶性肿瘤患者口腔念珠菌分离株中,白色念珠菌的致病性明显高于非白色念珠菌。

龙胆泻肝汤氯仿提取物抑制白念珠菌VVC临床株水解酶活性

该研究探讨龙胆泻肝汤氯仿提取物(CELX)对白念珠菌VVC临床株外分泌水解酶的影响。分别采用牛奶培养基、蛋黄培养基、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温-80)培养基对15株白念珠菌VVC临床株进行分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)、磷脂酶(PL)、脂肪酶(Lip)阳性菌株的筛选;牛奶平板法、蛋黄平板法、吐温-80平板法分别检测CELX干预后,Sap,PL与Lip的活性变化;qRT-PCR检测基因SAP1~7,10,PLB1~2,LIP3~6的表达量。结果可见,15株VVC临床株的Sap,PL均为阳性,11株Lip阳性菌株。随着CELX剂量的递增,与空白对照组相比,各含药培养基(牛奶培养基、蛋黄培养基、吐温-80培养基)上菌落的沉淀圈逐渐减小,当药物达256 mg·L-1时,菌落沉淀圈几乎消失,酶活力显著减弱。qRT-PCR结果显示,256mg·L-1CELX时,除SAP5,SAP6外,SAP1,SAP2,SAP3,SAP4,SAP7,SAP9,SAP10分别下调了62%,55%,62%,84%,61%,51%,68%;PLB1下调了67%;LIP3,LIP4,LIP6分别下调了51%,54%,55%。研究表明,CELX能抑制白念珠菌重要毒力因子天冬氨酸蛋白酶、磷脂酶与脂肪酶的活性。

白假丝酵母菌分泌型天冬氨酸蛋白酶与重症婴幼儿龋的相关性

目的探讨白假丝酵母菌分泌型天冬氨酸蛋白酶(SAP)与重症婴幼儿龋(S-ECC)的相关性。方法以S-ECC患儿和无龋儿童口腔内的白假丝酵母菌临床分离菌株共40株为研究对象,分别采用YNB-BSA琼脂平板法及以牛血清白蛋白为底物配合四甲基偶氮唑盐法对比测定SAP蛋白酶活力,比较两组间SAP水平的差异;并分析SAP水平与25S rDNA基因分型的相关性。结果全部白假丝酵母菌菌株均表现为SAP蛋白酶阳性,且两种检测方法均显示S-ECC组的SAP蛋白酶水平(0.36±0.03、1.59±0.92)高于无龋组者(0.39±0.05、0.79±0.26),差异具有统计学意义(P=0.013、P<0.001);40株白假丝酵母菌25S rDNA基因型分为A、B、C三型,B型仅在S-ECC组出现,S-ECC组白假丝酵母菌A、B、C三型的SAP蛋白酶活力间差异无统计学意义(P=0.323、P=0.492)。结论白假丝酵母菌SAP表达水平升高可能与S-ECC的进展密切相关;但其酶活力高低与25SrDNA基因分型并无明显相关性。

白色念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶研究进展

分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartyl proteinase,SAP)是白色念珠菌的毒力因素之一,它参与白色念珠菌的黏附与侵袭,在白色念珠菌致病过程中发挥了重要作用。目前对于SAP的研究主要集中在其结构、理化性质、基因调控、抑制因素等方面,也有涉及其与相关口腔黏膜病的关系。本文就近年来有关SAP的研究进展做一综述。

分泌型天冬氨酸蛋白酶—抗真菌药物作用的新靶点

近年来,随着临床上致病真菌耐药性的日趋严重,寻找具全新作用机制的新型先导化合物成为抗真菌药物研究的重要方向。大量实验证明,分泌型天冬氨酸蛋白酶(Sap)是白色念珠菌致病的重要因素,将成为一个极具前景的抗真菌药物作用新靶点。该文综述了Sap的生物学性质与功能、催化反应机制、三维结构及抑制剂等方面的研究进展。