橡胶树新种植材料——自根幼态无性系

大田试验结果表明:橡胶微繁无性系离地50 cm处平均茎围为对照(老态的供体无性系)的1303%,花药体细胞植株离地50cm处平均茎围为对照(老态的供体无性系)的109.1%～120.2%,头4 a平均单株干胶产量为对照的129.9%～146.3%,自根幼态无性系和供体无性系相比,这2个性状均达显著差异.说明橡胶自根幼态无性系是一种速生、高产的种植材料.

离体培养橡胶树体细胞诱导纯多倍性无性系方法的研究初报

研究结果表明，用0．5％的秋水仙素处理橡胶树二倍体花药体细胞愈伤组织（浸泡或滴渍）1d可有效地从多倍性的细胞再分化成多倍性胚状体并再生植株。所诱导培育获得的多倍胚状体及植株，通过细胞学鉴定表明具有多倍体表型特征的，其体细胞染色体数为2n＝72，未见嵌合现象，对照的2n＝36。

橡胶树MSAP反应体系的建立及其对无性系DNA的甲基化分析

采用改良CTAB法提取橡胶树幼嫩叶片的基因组DNA,通过电泳检测酶切与连接、预扩增和选择性扩增等,建立橡胶树MSAP甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系,并利用MSAP技术在基因组水平上对橡胶树幼态优势的形成机理进行研究。结果表明:利用该体系可获得扩增位点多、条带清晰、重复性好的图谱(共扩增出740个条带,404个甲基化位点,平均多态性比例为54.6%),并能有效区分基因组DNA甲基化的状态,为开展橡胶树同一品种不同类型种植材料的表观遗传变异研究奠定了基础。

巴西橡胶树自根幼态无性系耐低温分析

为比较橡胶树新型种植材料——自根幼态无性系与同源老态芽接无性系的耐低温能力,本研究将1蓬叶稳定的热研7-33-97老态芽接苗和自根幼态无性系苗5℃低温处理后,测定叶片的相对电导率、可溶性糖含量和游离脯氨酸含量等生理指标,并进行叶片受害调查。结果显示,自根幼态无性系叶片相对电导率低于老态芽接苗,可溶性糖含量和游离脯氨酸含量均高于老态芽接苗。此外,对5℃处理4 d后叶片受害情况调查发现,自根幼态无性系大部分叶片未受害,而老态芽接苗叶片几乎全部干枯或脱落。因此,室内低温模拟实验表明,自根幼态无性系在耐低温能力方面较老态芽接无性系更强,这为自根幼态无性系的生产应用提供了更广阔的前景。

棉铃虫保幼激素环氧水解酶基因的克隆及其原核表达

通过兼并引物PCR结合RACE技术,克隆了棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)保幼激素环氧水解酶(juven-ile hormone epoxide hydrolase,JHEH)的基因,该基因的开放阅读框为1389bp,编码463个氨基酸。预测蛋白分子量为52kD,等电点为6.39。N末端存在由20个氨基酸组成的疏水性信号肽序列,存在组成JHEH催化三联体的氨基酸Asp(227)、Glu(403)和His(430)以及组成阴氧离子洞的氨基酸Tyr(298)、Tyr(373)和HGWP花样结构。其氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫有很高的同源性。在大肠杆菌中表达JHEH基因的编码区,Western blot结果表明,棉铃虫JHEH已被成功表达。利用该基因序列可以在分子水平上研究棉铃虫JHEH基因的时空表达情况,进一步研究保幼激素(juvenile hormone,JH)的代谢途径及其功能。

日本落叶松无性系管胞力学性质的遗传变异

对4个12年生的日本落叶松无性系幼龄材早材单根管胞进行了拉伸实验。结果表明:日本落叶松无性系幼龄材早材单根管胞拉伸弹性模量、拉伸强度和断裂伸长率的均值分别为11.44 GPa、616.59 MPa和6.54%,相应的变异系数为26.97%、26.26%和23.17%。方差分析表明日本落叶松幼龄材早材单根管胞拉伸弹性模量和管胞断裂伸长率在无性系间差异极显著(0.01水平),拉伸强度在无性系间差异不显著;株内早材单根管胞拉伸弹性模量、拉伸强度和管胞断裂伸长率在年轮间差异显著。对日本落叶松无性系幼龄材早材单根管胞拉伸力学性能进行遗传参数估计,单根管胞弹性模量和断裂伸长率的重复力分别是0.79和0.57,属于中度到强度遗传控制,无性系早期选择及材性遗传改良潜力较大。

小麦吸浆虫保幼激素酯酶和保幼激素环氧水解酶基因的克隆及在滞育和变态发育过程中的表达动态

【目的】保幼激素(juvenile hormone, JH)在小麦吸浆虫Sitodiplosis mosellana滞育诱导及滞育后静息状态的维持中发挥着重要作用。保幼激素酯酶(hormone esterase, JHE)和保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)是调控JH滴度的重要降解酶。本研究旨在探讨JHE和JHEH在小麦吸浆虫滞育和变态发育中潜在功能。【方法】通过RT-PCR和RACE技术从小麦吸浆虫滞育前幼虫克隆JHE和JHEH全长cDNA序列;利用生物信息学软件分析其核苷酸及编码蛋白特性;采用qPCR技术分析其在小麦吸浆虫滞育不同时期(滞育前、滞育期、滞育后静息期和滞育后发育)3龄幼虫及1龄幼虫到成虫不同发育阶段(1-2龄幼虫、预蛹、初蛹、中蛹、后蛹、雌成虫和雄成虫)中的表达水平。【结果】克隆获得了cDNA全长分别为3 102和1 980 bp的小麦吸浆虫SmJHE和SmJHEH基因(GenBank登录号分别为MG876768和MG876769),其开放阅读框分别长1 740和1 371 bp,分别编码579和456个氨基酸,预测蛋白分子量分别为65.67和51.65 kD。SmJHE蛋白含有5个JHE家族特有的保守模块,SmJHEH含有催化三联体Asp228, Asp404和His431及组成阴氧离子洞的两个Tyr(Tyr299和Tyr374)和HGWP花样结构。序列比对和进化分析表明,SmJHE和SmJHEH均与双翅目(Diptera)长角亚目(Nematocera)昆虫同源蛋白氨基酸序列一致性较高,亲缘关系最近。不同滞育时期的表达模式表明,SmJHE和SmJHEH在滞育前期(1龄到滞育前的3龄幼虫早期)表达量变化不明显,进入滞育后表达量基本维持恒定,但均在滞育后静息阶段的当年12月至翌年1月最低。发育表达模式表明,幼虫恢复发育后SmJHE表达量逐渐升高,预蛹期达到最高,在雌成虫中的表达量显著低于雄成虫中的;SmJHEH表达量则在预蛹期最低,在雌成虫中最高。【结论】SmJHE和SmJHEH参与小麦吸浆虫滞育调控,其表达量的降低与滞育后静息阶段JH的累积有关;SmJHE在发育过程中表达量的升高可能参与幼虫到蛹的变态,表达量的降低可能与生殖发育有关。

橡胶树幼态与老态无性系间的MSAP分析

利用MSAP技术,检测橡胶树热研8-79幼态无性系与老态无性系DNA甲基化差异。结果表明,幼态无性系的DNA甲基化水平为33.2%,老态无性系的DNA甲基化水平为22.9%,两者基因组DNA甲基化水平有一定差异,而且DNA甲基化模式也不同。对部分差异片段经同源性比对分析可知,同源序列的功能主要与代谢、细胞生长相关。这些差异可能是导致橡胶树幼态与老态无性系间性状差异的原因。

橡胶树老幼态无性系对低温胁迫的生理响应

为了解橡胶树老幼态无性系植株的抗寒生理特性,比较其抗寒能力。以3个橡胶树品种老幼态芽接无性系的一年生休眠枝条为试验材料,通过人工模拟低温胁迫(4℃对照、2℃、0℃、-2℃、-4℃)处理后,测定其相对电导率、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H 2 O 2)、游离脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量6个指标,分析各指标随温度下降的变化规律,利用隶属函数法综合评价各无性系老幼态植株的抗寒性。结果表明,随胁迫温度的降低,橡胶树老幼态无性系枝条相对电导率均呈上升的趋势;MDA和H2O2呈先上升后下降的趋势;多数无性系游离脯氨酸和可溶性糖含量呈“降-升-降”的变化趋势;可溶性蛋白含量呈先上升后下降的趋势。所有幼态无性系相对电导率、H2O2含量及可溶性蛋白含量均低于老态无性系;多数幼态无性系丙二醛低于老态无性系;多数幼态无性系游离脯氨酸和可溶性糖含量高于老态无性系。各无性系抗寒性进行综合评价结果表明,3个品种幼态无性系的平均隶属度都远高于老态无性系。参试的橡胶树品种幼态无性系的抗寒性都比老态无性系强。研究结果为橡胶树幼态无性系的利用潜力和栽培方式提供了参考。

冬季低温对2个橡胶树无性系老幼态植株抗寒生理指标的影响

为研究橡胶树老幼态无性系植株在自然越冬过程中枝条生理指标的变化规律,以2个橡胶树无性系老幼态植株的一年生休眠枝条为试验材料,对其在自然越冬过程中(2018年11月至2019年2月中旬)的相对含水量、电解质渗出率、抗氧化能力指标(丙二醛含量、超氧阴离子产生速率、超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性)和渗透调节物质(氨基酸、游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量)进行测定,并用隶属函数法对橡胶树无性系老幼态植株的抗寒性进行综合评价。结果表明:自然越冬过程中2个橡胶树无性系老幼态植株枝条生理指标随时间的变化呈现规律性变化,且老幼态植株间各指标也有一定的差异。其中,相对含水量呈“降-升-降”变化,整个越冬过程中变化不大;电解质渗出率和丙二醛含量表现为先上升后下降,峰值出现在越冬中后期(1月2日至1月22日);超氧阴离子产生速率呈现“降-升-降”的趋势,峰值出现越冬前期和中期(11月和1月);超氧化物歧化酶与过氧化物酶活性呈“升-降-升”的趋势,峰值出现在越冬前期(12月13日);游离脯氨酸和可溶性糖含量呈先降后升的变化趋势,最小值出现在越冬中期(1月);可溶性蛋白含量呈先升后降的趋势,峰值出现在越冬中期(1月);氨基酸含量越冬前中期相对变化不大,越冬后期大幅上升。利用隶属函数法进行综合评价得出,2个橡胶树无性系幼态植株的抗寒性平均隶属度均大于老态无性系,说明参试的无性系幼态植株抗寒性强于老态植株。

不同杨树无性系幼龄材和成熟材化学成分的比较

【目的】研究5个杨树无性系幼龄材和成熟材的化学成分,为杨树优良无性系的选择和杨树制浆造纸利用提供依据。【方法】选择欧美杨107杨（Populus×euramericana‘Neva’）、中汉22杨（P.×deltoidescv.‘Zhonghan-22’）、皖林1号杨（P.×deltoidscv.‘Wanlin-1’）、Z9（P.×deltoidscv.‘Z9’）和B3（P.×deltoidscv.‘B3’）5个杨树无性系为研究材料,参照有关国家标准,分别测定其幼龄材和成熟材的化学成分,通过单因素方差分析,比较不同无性系及不同材龄之间的差异性。【结果】综纤维素、纤维素、木质素、苯醇抽提物、10 g/L NaOH抽提物的含量,在所测的5个杨树无性系试样中分别为749.7-830.7,398.1-434.1,177.1-198.0,8.8-14.8和190.2-237.2 g/kg。5个杨树无性系成熟材中的综纤维素和纤维素含量均高于幼龄材,木质素含量均低于幼龄材;苯醇抽提物含量除皖林1号杨外,其余无性系均表现为成熟材大于幼龄材;10 g/L NaOH抽提物含量在不同无性系之间差异较大。幼龄材与成熟材之间,综纤维素含量差异极显著（P〈0.01）,苯醇抽提物含量差异显著（P〈0.05）,其余化学成分差异均不显著;不同无性系之间,综纤维素含量和10 g/L NaOH抽提物含量在P=0.001水平上差异显著,木质素含量在P=0.01水平上差异显著,其余化学成分差异均不显著。【结论】从化学成分来看,5个杨树无性系均是制浆造纸的优良原料。由于无性系之间化学成分差异显著,幼龄材与成熟材之间化学成分也存在差异,因此建议在选择制浆造纸原料时,应优先考虑无性系的影响。

烟粉虱MED隐种保幼激素酯酶cDNA片段克隆、序列分析及在不同发育阶段的表达

昆虫卵黄发生及其内分泌调控机理一直是昆虫生殖生理学的研究热点。由保幼激素代谢通路关键分子介导的调控系统是影响昆虫卵黄发生的关键途径。研究激素代谢通路关键调控因子的功能将为明确生殖调控机理提供理论依据。保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE)是降解昆虫体内保幼激素的关键酶之一,具有调控昆虫发育、变态和生殖等功能。本实验以烟粉虱Bemisia tabaci MED隐种为研究对象,采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增PCR(rapid amplification of cDNA ends PCR,RACE-PCR)技术克隆获得编码552个氨基酸的烟粉虱MED隐种保幼激素酯酶基因的部分cDNA序列,将其命名为Btjhe(GenBank登录号为KC422259)。同源序列比对发现,该基因与菜叶蜂Athalia rosae、西方蜜蜂Apis mellifera的保幼激素酯酶基因推导的氨基酸一致性较高,且具有昆虫保幼激素酯酶共有的5个氨基酸保守模块,其中包括对保幼激素酯酶活性起关键作用的长疏水结合域GxSxG。由此推测,Btjhe为烟粉虱MED隐种的保幼激素酯酶基因,其编码蛋白参与烟粉虱体内保幼激素的特异性降解。实时荧光定量PCR检测结果表明,Btjhe在烟粉虱若虫、成虫阶段都有表达,在成虫阶段表达量较高,且在羽化后11d达到峰值,其表达模式与卵黄原蛋白基因(vg)类似。本研究结果为明确烟粉虱的生殖调控机理奠定基础。

黄条鰤(Seriola aureovittata)MyHC基因克隆及其在早期发育阶段表达研究

为解析肌球蛋白重链(MyHC)基因在黄条鰤(Seriola aureovittata)生长发育过程中作用机制,本研究采用RACE技术,克隆了黄条鰤MyHC基因全长cDNA序列,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对MyHC在黄条鰤不同组织、胚胎发育过程以及仔稚幼鱼发育过程中的表达特征进行了研究。结果表明:黄条鰤MyHC基因全长为6143bp,开放阅读框为5811bp,编码了1936个氨基酸,由3个保守结构域组成即MYSc-classⅡ、Myosin taill和SH3;系统进化树分析显示黄条鰤MyHC与高体鰤进化关系最近。qRT-PCR分析发现黄条鰤MyHC在各组织中均有表达,但在肌肉中表达量最高(P<0.05);随着黄条鰤胚胎发育的进行,MyHC在16细胞期之前表达量较高,在胚体下包2/3时期表达量显著升高,且在孵化期达到峰值(P<0.05:);在仔稚幼鱼发育阶段,MyHC在孵化后20d后表达量显著升高,30d表达水平达到峰值(P<0.05),随后的35d到40d表达水平略有下降但仍保持较高表达趋势,黄条鰤MyHC表达具有发育阶段表达的特异性。MyHC表达特征揭示其参与了调控黄条鰤的早期生长发育。

家蚕保幼激素甲基转移酶基因的克隆与表达分析

根据家蚕表达序列标签(ESTs),克隆了一个家蚕保幼激素甲基转移酶基因(JHAMT2)的全长cDNA序列。序列分析表明,该基因全长1007 bp,序列分析有4个外显子,定位于家蚕第12号染色体的nscaf 2 993上,推导的编码蛋白序列长度为266AA,有一个甲基转移酶超家族功能位点,与烟草天蛾(Manduca sexta)JHAMT同源性达到38%。JHAMT2基因在家蚕丝腺、特别是中部丝腺组织特异表达,发育时期表现为4龄期有比较高的表达量,5龄期只在5龄第3日有表达,性别差异表现为雄性体内持续表达时间比雌性中长。JHAMT2基因表达受到外源激素MH的负调控和JHA的正调控,雌性对外源昆虫激素的感受更敏感。

巴西橡胶树HbCMT1的克隆与表达分析

通过PCR和RACE技术克隆获得了巴西橡胶树染色质甲基化酶(CMT,chromomethylase)基因(Hb CMT1)。Hb CMT1全长2697 bp,含有2556 bp的阅读框,编码851个氨基酸。推测Hb CMT1分子量为95.67 k D,等电点为5.38,氨基酸序列与可可、烟草、葡萄、黄瓜、鹰嘴豆和拟南芥等CMT家族成员的同源性分别为66%、51%、50%、56%、53%和50%。定量PCR分析表明Hb CMT1在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在叶中表达量最高,在胶乳中表达量最低。此外Hb CMT1在橡胶树自根幼态无性系胶乳中的表达量比老态无性系胶乳中的低。

巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,MET)基因(Hb MET)。Hb MET长4 896 bp,含有4 635 bp的阅读框架,编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku,等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明,Hb MET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。Hb MET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低;Hb MET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。

七星瓢虫保幼激素环氧水解酶基因克隆及表达分析

保幼激素(juvenile hormone, JH)可以调控昆虫滞育,保幼激素环氧水解酶(juvenile hormone epoxide hydrolase, JHEH)是调节保幼激素代谢的关键酶之一。为探索JHEH在七星瓢虫Coccinella septempunctata L.滞育中的调控作用,利用RT-PCR和RACE技术克隆获得七星瓢虫JHEH全长基因,命名为Csjheh(GenBank登录号:MH932586),该基因cDNA全长2 077 bp,开放阅读框(ORF)1 380 bp,编码459个氨基酸,预测蛋白质分子量为51.39 kD,理论等电点(pI)为8.79。疏水性分析结果显示该基因具有典型环氧水解酶的N末端疏水结构。氨基酸序列比对结果表明,Csjheh与中欧山松大小蠹、赤拟谷盗、丽蝇蛹集金小蜂、内华达古白蚁保幼激素环氧水解酶同源性达到64.24%。利用实时荧光定量PCR技术研究其时空表达模式,结果表明Csjheh基因在七星瓢虫成虫初羽化阶段表达量较高,滞育诱导条件下表达量呈先下降后上升的趋势,滞育60 d时与初羽化阶段接近。本研究结果对揭示JHEH参与JH的调控作用,进而调控昆虫滞育提供了理论参考。

灰飞虱保幼激素结合蛋白基因的克隆及表达动态

克隆了灰飞虱的1个保幼激素结合蛋白(JHBP)基因,命名为LstrJHBP(GenBank登录号:JF728808)。该基因全长1 514 bp,开放阅读框编码289个氨基酸,5'和3'UTR区分别为124和522 bp,预测的相对分子质量为32 599,等电点5.47。综合信号肽预测、氨基酸序列比对及聚类分析结果,推测LstrJHBP是一个细胞质JHBP。qRT-PCR测定表明,LstrJHBP在灰飞虱若虫5个龄期及雌雄成虫均有表达,但4龄若虫期显著高于其他龄期,雌雄成虫间没有显著差异。研究结果为进一步明确灰飞虱的发育及变态调控机制奠定了基础。

马尾松无性系木材基本密度和纤维形态的变异及选择

【目的】研究马尾松Pinus massoniana在产地间和产地内的无性系木材基本密度和纤维形态的遗传变异规律,为马尾松良种选育和改良提供优质的遗传材料。【方法】从浙江省淳安县姥山林场34年生马尾松无性系试验林中,选出5个不同产地的50个无性系为研究对象,测定其木材基本密度、纤维长度、纤维宽度和纤维长宽比。通过方差分析、相关性分析及遗传参数估算揭示其遗传变异规律,并采用独立选择标准法对50个无性系进行选优。【结果】方差分析结果表明:木材基本密度、纤维形态在产地间和产地内的无性系间皆存在显著(P<0.01)或极显著(P<0.001)差异。其中,木材基本密度、纤维长度和纤维长宽比变异主要来源于产地内无性系间,占总变异的19.37%~28.26%;纤维宽度的遗传变异主要来自于产地间变异,占总变异的45.57%。木材基本密度与纤维长度、纤维长宽比存在极显著(P<0.001)的表型和遗传负相关,与纤维宽度相关不显著(P>0.05)。纤维形态指标在幼龄—成熟期呈极显著(P<0.001)的遗传正相关,而木材基本密度在幼龄—成熟期的相关不显著(P>0.05)。共选出12个材性优良的马尾松无性系。【结论】马尾松木材基本密度、纤维长度、纤维长宽比3个性状在改良过程中应注重产地内优树的选择。而纤维宽度通过产地间选择能达到较好的改良效果。鉴于纤维形态在幼龄—成熟期相关性极显著,可作为材性早期选择指标。

棉蚜保幼激素环氧水解酶基因克隆及表达初步分析

保幼激素环氧水解酶(Juvenile hormone epoxide hydrolase,JHEH)在保幼激素(Juvenile hormone,JH)的代谢途径中起重要的降解作用。为初步分析JHEH在棉蚜(Aphisgossypii Glover)生长发育中可能存在的功能,本研究通过转录组测序并结合RACE技术,克隆AgosJHEH基因,其开放阅读框为1401 bp,编码466个氨基酸,预测蛋白质分子量为52.6kDa,等电点8.19。N末端存在由20个氨基酸组成的疏水性信号肽序列,存在催化三联体Asp(230)、Glu(408)、His(437)氨基酸残基以及阴氧离子洞Tyr(304)、Tyr(378)和HGWP花样结构氨基酸残基,与豌豆蚜氨基酸序列有很高的同源性。RT-qPCR结果表明AgosJHEH在棉蚜无翅若虫3、4龄表达量显著低于其他龄期,在无翅成虫中各生命时期没有显著差异,有翅成虫腹部显著低于翅中的表达量。本研究首次对AgosJHEH进行结构分析及功能预测,为深入理解其对棉蚜JH滴度的调控机制及开发新型杀虫剂奠定基础。