基于PCR-SSP技术的RhCE血型基因型检测方法

目的 基于序列特异性引物PCR(PCR-SSP)技术建立一种用于检测临床标本红细胞RhCE血型基因型的快速定型方法。方法 将2023年9至12月宁波大学附属第一医院收检的152例乙二胺四乙酸抗凝血样分别采用试管法、间接抗人球法和微柱凝胶卡法检测RhD血型和RhCE血型。采用硅基质柱法提取样本DNA。采用Sanger测序法选择RhCE基因标准品序列。采用PCR-SSP法确定检测RhC和Rhc、RhE和Rhe两对等位基因的4对序列特异性引物。采用TA克隆技术得到重组质粒并评估序列特异性引物的灵敏度和抗干扰性能。采用PCR-SSP法检测样本,并与血清学结果进行一致性评价。结果 用表型分别为CCee、CcEe、ccEE的3个标本成功确定不同RhCE基因型的标准品序列。4对序列特异性引物能有效区分RhC和Rhc、RhE和Rhe两对等位基因。序列特异性引物在对应等位基因1:128干扰下仍能检测出且灵敏度为10~4~10~5拷贝数/μL。临床样本RhE、Rhe和Rhc基因型检测结果与表型一致性为100.00%,但RhC基因型与表型一致性只有92.76%,其中RhD阳性背景人群中的一致率为98.39%,RhD阴性背景人群中一致率为88.89%。结论 PCR-SSP技术在红细胞RhCE血型基因型快速鉴定方面具有可行性,检测RhE、Rhe和Rhc基因型与表型具有较高的一致性,对RhC基因型的检测,需区分不同RhD血型背景,建议使用两种及以上的方法进行综合判断。

序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)结合血清学在疑难血型鉴定中的应用

目的 探讨血型血清学与序列特异引物引导的聚合酶链式反应(PCR-SSP)基因分型在ABO疑难血型鉴定中的作用。方法 用血清学分析鉴定的ABO疑难血型标本80例,同时采用PCR-SSP法进行基因分型,结合两种方法学结果,确定血型及制定输血策略。结果 血清学鉴定亚型40例,其他原因引起的抗原抗体缺失或减弱正常血型40例;PCR-SSP法基因分型亚型41例(3例二者结果不一致:血清学Ael型1例,基因分型O2O2;血清学O型1例,基因分型BO1;血清学A型1例,基因分型AB),正常血型39例。结论 使用血清学结合基因分型鉴定ABO疑难血型具有重要意义。

The application of sequence specific primer and RT-PCR to LRRK2 gene polymorphism typing

Objective:To establish a new detecting method for disease susceptibility loci R1628P and G2385R of Parkinson’s disease(PD)related gene LRRK2.Methods:Sequence specific primers were designed to make a genotyping of DNA markers with known genotypes by use of quantitative fluorescence real-time PCR(RT-PCR).100 cases of PD samples with unknown genotypes were tested,and verified by use of polymerase chain reaction linked restriction fragment length polymorphism(PCR-RLFP).Results:The genotyping results of DNA markers proved to be correct,and 100 cases of samples to be tested had a completely consistent genotyping result with PCR-RLFP genotyping result.Conclusions:Sequence specific primer and quantitative fluorescence RT-PCR can successfully make a genotyping for disease susceptibility loci R1628P and G2385R of LRRK2.

PCR-SSP技术对广东汉族人HLA-DR基因分型

探索具有高分辨率、高特异性和简捷快速的方法对ＨＬＡ－ＤＲ基因分型，为临床器官移植配型和疾病相关性分析提供实用的方法和基础资料．利用ＤＲ１～ＤＲｗ１８序列特异性的１９组引物及１对内参照引物进行ＰＣＲ扩增即ＰＣＲ－ＳＳＰ对ＨＬＡ－ＤＲ进行基因分型，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察分型结果．每个被检个体的ＤＲ型别可由特异引物扩增出现的电泳谱带直接判断．双盲检测２２例的结果１００％正确．在１０２例中国广东地区汉族人中，ＤＲ９和ＤＲ２的基因频率最高，分别为０．２２０５和０．１９１２，ＤＲ１０为最低（０．００９８）．与用ＰＣＲ－ＳＳＯ方法分型获得的结果比较，基因型别分布基本一致，但一些等位基因的频率有差异，表明ＨＬＡ－ＤＲ基因频率的分布在不同地区、不同种族的人群间存在着差异．ＰＣＲ－ＳＳＰ法分辨率和特异性虽不及ＰＣＲ－ＳＳＯ法但比血清学方法精细，分型的全过程只需２～４ｈ能满足临床器官移植配型的要求．基因频率调查结果为器官移植配型和疾病相关性分析提供了基础资料．

PCR-SSP法检测胎儿、新生儿ABO血型

目的 研究用PCR SSP法鉴定胎儿、新生儿血型及基因型。方法 用PCR SSP法检测 5 6例 16周以上孕妇的胎儿、新生儿脐血红细胞基因型 ;用常规法检测双亲及胎儿、新生儿血红细胞ABO血型。结果 用PCR SSP法检测出全部 5 6例脐血ABO血型及基因型 ;PCR SSP法检测出的子代血型与由父母血型按孟德尔遗传规律推测的子代血型符合率达 10 0 % ;用常规法检测脐血ABO血型 ,检出率为 87.5 %。结论 PCR SSP法检测子代ABO血型方法可靠 。

应用Q-PCR定性检测KIR基因有无方法的建立

目的建立定性检测KIR基因有无的Q-PCR方法。方法根据高分辨水平中国人群KIR等位基因的多态性,并参考国际IPD-KIR数据库,针对16种KIR基因及2DS4-Normal、2DS4-Deleted两种亚型,设计KIR基因特异性引物用于Q-PCR扩增反应;同时设置一孔阴性对照、一孔阳性对照(特异性扩增人体生长激素HGH基因片段),以监控假阳性、假阴性的结果。为验证Q-PCR方法的可靠性,随机选择302份已采用KIR PCR-SSP商品化试剂盒检测的标本,采用Q-PCR方法盲检和对比。结果300人份的Q-PCR检测结果与已知的PCR-SSP检测结果相符,有2份标本结果不一致,其中1例标本的2DS5基因Q-PCR检测结果为阴性,而PCR-SSP检测结果为阳性;另一例标本2DS1基因Q-PCR检测结果为阳性,而PCR-SSP检测结果为阴性。对2份标本分别进行2DS5、2DS1基因测序分型,证实Q-PCR定性检测结果正确。结论本文建立的KIR Q-PCR方法结果准确、可靠,可用于KIR基因有无的定性检测。

人类血小板抗原1～6和Gov系统的PCR-SSP同步基因分型

目的：采用序列特异性引物PCR（PCR—SSP）对人类血小板抗原（HPA）1-6、Gov系统进行同步基因分型，以确定中国大陆汉族人群中的HPA等位基因频率。方法：随机采集100名中国大陆汉族无偿献血者外周血标本，采用酚／氯仿方法提取基因组DNA。设计合成21条序列特异性引物，在相同的PCR循环条件下对HPA-1-6和Gov进行PCR-SSP同步基因分型。结果：100名随机供血者中观察到的基因频率分别是HPA-1a和1b为1．000和0．000，HPA-2a和26为0．995和0．005，HPA-3a和36为0．655和0．345，HPA-4a和46为1．000和0．000，HPA-5a和56为0．990和0．010，HPA-6a和66为0．980和0．020，Gov^a和Gov^b为0．515和0．485。中国人HPA—1．6、Gov的基因频率与亚洲其他人群相一致，HPA-3a／3b和Gov^a／Gov^b基因频率在包括高加索人在内的不同人群中基本相等。结论：中国大陆汉族人群中Gov和HPA-3等位基因分布有其自身特点。

PCR-SSP法HLA-A、B基因分型与血清学分型的比较

目的比较聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-Ⅰ类A、B抗原位点分型的准确性,并探讨血清学分型错误发生的原因。方法用PCR-SSP以及单克隆抗体血清学分型技术对HLA-A、B分型并比较。结果34例样本PCR-SSP基因分型无假阳性和假阴性出现。PCR-SSP法与血清学比较,血清学检出错误或漏检率分别为HLA-A位点23.5%,B位点26.5%。血清学发生错误或易混淆的抗原有:A2和A68、A32和A33,B5、B60和61。结论PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原等位基因分型具有分辨率高、特异性强、重复性好、实验过程简捷快速、分型结果较血清学更加准确可靠的优点。

Flow-rSSO与PCR-SSP方法在骨髓库HLA基因分型中的应用比较

目的比较流式反向序列特异性寡核苷酸探针方法(Flow-rSSO)与聚合酶链式反应-序列特异性引物方法(PCR-SSP)在骨髓库人类白细胞抗原(HLA)分型中的应用价值。方法4769例中华骨髓库质控样本中,已采用PCR-SSP方法分型的3509例标本应用FLOW-rSSO方法复检,而1260例已采用FLOW-rSSO方法分型样本则应用PCR-SSP方法复检,结果不一致样本采用PCR-测序分型方法(SBT)进行确认。结果PCR-SSP方法HLA分型错误率(6.84‰)明显高于Flow-rSSO方法(1.59‰),其中PCR-SSP方法中75%的错误结果是由于漏检造成;PCR-SSP方法的模棱两可分型结果比例(2.56‰)明显低于Flow-rSSO方法(16.67‰)。结论PCR-SSP方法和FLOW-rSSO方法均适合应用于中华骨髓库供者的HLA分型,但HLA分型实验室有必要同时建立两种HLA分型方法。

PCR-SSP法、FCM法及MLCT法检测强直性脊柱炎患者HLA-B_(27)对比分析

目的:探讨序列特异性引物——聚合酶链反应(PCR-SSP)法、流式细胞仪(FCM)法及微量淋巴细胞毒(MLCT)法检测血清人类白细胞抗原-B27(HLA-B27)对强直性脊柱炎的诊断价值。方法:将58例确诊的强直性脊柱炎患者作为观察组,58例健康体检者作为对照组,分别采用PCR-SSP法、FCM法及MLCT法检测血清HLA-B27,分析3种方法诊断强直性脊柱炎的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。结果:PCR-SSP法、FCM法、MLCT法检测血清HLA-B27诊断强直性脊柱炎的灵敏度分别为96.55%、93.10%、82.76%,特异度分别为94.83%、91.38%、93.10%;PCR-SSP法、FCM法的灵敏度显著高于MLCT法,差异有统计学意义(P<0.05);3种方法均有较高的特异度,差异无统计学意义(P>0.05);PCR-SSP法具有较高灵敏度和特异度。阳性预测值分别为94.92%、91.53%、92.31%,阴性预测值分别为96.49%、92.98%、84.38%。3种方法均有较高的阳性预测值,差异无统计学意义(P>0.05);PCR-SSP法、FCM法的阴性预测值显著高于MLCT法,差异有统计学意义(P<0.05);PCR-SSP法具有较高的阳性预测值和阴性预测值。结论:3种检测方法对诊断强直性脊柱炎均有较高的特异度和阳性预测值,PCR-SSP法具有较高灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值。

PCR-SSP技术检测乳腺癌易感基因

[目的]建立简易的PCR方法检测BRCA1及其等位基因。[方法]根据BRCA1基因(EMBL/GenBank/DDBJU14680)和在中国人乳腺癌患者中高频存在的BRCA1-2201T2430C2731T3232G3667G等位基因(AY304547)序列,设计二对特异性引物,分别针对正常BRCA1和上述等位基因,同时引入一对内对照引物,建立简易的序列特异性引物-PCR技术(PCR-SSP),并用于检测30份已知BRCA1序列的乳腺癌患者DNA样本,以及67名未知的健康女性捐血者样本。[结果]30份已知的患者DNA样本的PCR-SSP检测结果与样本的序列完全相符。67名健康女性检测结果显示6名个体(9.0%)为等位基因纯合体,32人(47.8%)携带正常BRCA1,其余29名个体(43.3%)为杂合体。[结论]PCR-SSP方法能特异性检测BRCA1基因和BRCA1-2201T2430C2731T3232G3667G等位基因,可作为检测该等位基因以及判断个体在这一突变热点位点是否发生变异的简易手段。

PCR-SSP方法在精神疾病分子研究水平中的应用

目的建立多个基因多态性分型的聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)的方法,以推广其在精神疾病分子研究水平中的应用。方法应用PCR-SSP的方法分析TNFα-308A/G和-238G/A变异I、L-6-174G/C变异、CYP2D6*10B外显子第188位的C/T变异、COMT基因的第472位编码序列的G/A变异、MAOA基因位于第8外显子CDNA顺序的第941位点的G/T变异等基因的多态性。结果应用同一个PCR扩增程序,可同时对多个基因、多个临床样本的多态性进行分析,基因型清晰,而且基因分型快速、准确。结论PCR-SSP适合对大样本、多个基因的单核苷酸位点变异进行多态性分析,快速、准确,值得在精神病分子水平的研究中推广。

应用PCR-SSP技术对云南拉祜族人HLA-DRB1进行基因分型

目的了解云南拉祜族健康人HLA-DRB1基因的遗传多态性。方法应用PCR-SSP技术对110名无亲缘关系的云南拉祜族健康人进行HLA-DRB1基因分型。结果鉴定了拉祜族群体HLA-DRB1位点的16种等位基因,包括DRB1位点目前已知的全部血清学特异性,经检验DRB1位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.75)。结论提供了一套比较完整准确的云南拉祜族群体DRB1等位基因的基因频率,对群体遗传和疾病关联研究具有参考意义。

PCR-SSP与血清学技术用于ABO血型分型的比较

目的探讨ABO血型基因分型技术应用于临床检验的可行性。方法随机抽样100例江西健康汉族个体,并收集20例正反定型不符的标本,采用血清学和序列特异性引物PCR法(PCR-SSP)鉴定血型。结果 100例健康个体的基因分型结果与血清学分型结果一致,19例正反定型不符标本的基因分型结果准确。分型结果表明江西地区以O型为多,100例健康个体中,O型36例(36%),A型32例(32%),B型24例(24%),AB型8例(8%),基因频率:p(A)基因为0.2253,q(B)基因为0.1753,r(O)基因为0.5998,且符合Hardy-Weinberg平衡。结论基因分型技术应用于临床检验具有可行性,在鉴定疑难血型方面可以作为血清学分型的补充。

PCR—SSP基因分型技术在ABO疑难血型定型中的应用

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物（PC—SSP）基因分型技术在ABO疑难血型鏊定中的应用．方法收集8例来自广东省肇庆市无偿献血者的AB0疑难血型样本，采用正反定型实验、吸收放散试验等一系列血型血清学方法进行检测；提取基因组DNA，并用PCR—SSP基因分型毡术，特异性扩增ABO基因片段，根据有无PCR产物以及产物长度，判断样本的基因型。结果通过凝胶电泳检测PCR反应的特异性产物，判断样本1～6号A／30基因型为A／O型，样本7，8号为B／0型。8例疑难ABO基因分型结果与其血型的血清学分型结果吻合。结论ABO疑难血型定型的解决是一个复杂的难题，而PCR—SSP基因分型是一种方便、快速、可靠的技术，对于解决ABO疑难血型鉴定非常有用。

PCR-SSP/PCR-SSO两种KIR基因分型方法的比较

目的杀伤细胞免疫蛋白样受体(KIR)基因在自然杀伤细胞活性调节、机体抗感染、移植免疫过程中发挥重要作用。在脐带血移植中,KIR基因分型的效率和准确关系到移植的成败。为了满足临床上对KIR基因分型的要求,对比分析聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)和聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)两种方法,试图建立一个高效便捷检测KIR基因分型的方法学体系。方法从2018年到2019年已外送到第三方检测实验室(北京博富瑞医学检验实验室有限公司)做过KIR基因分型检测的脐带血样本中随机取出12份,分别用PCR-SSP及PCR-SSO商品化试剂盒进行KIR基因分型检测,并通过凝胶电泳分析或MATCH IT!DNA软件分析,获取KIR基因分型结果。结果12例脐带血样本中,PCR-SSO方法学检测的结果与原PCR-SSO方法检测结果完全一致,PCR-SSP方法学检测的结果与原PCR-SSO方法检测结果9例相同,有2例因出现漏孔而无法判读,有1例出现了假阳性带。结论PCR-SSO方法学检测KIR基因效果优于PCR-SSP,但是PCR-SSO方法学也存在当微珠的荧光校准值接近于临界值时,结果出现错判的现象;为保证KIR基因分型的准确度,建议PCR-SSP方法出现漏孔或者PCR-SSO方法荧光校准值接近于临界值时两种方法相互验证。

MLCT、PCR-SSP检测HLA-B_(27)的比较

目的比较强直性脊柱炎(AS)患者HLA-B27检测方法的特点。方法采用最常见的微量淋巴细胞毒试验(MLCT)、引物特异性聚合酶链反应(PCR-SSP),对30例AS患者及200例无偿献血者的HLA-B27抗原进行检测。结果两种方法之间的HLA-B27检出阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结果两种检测方法均准确可靠,且各具特点。HLA-B27检测对AS的早期诊断及鉴别诊断有重要意义。

PCR-SSP基因分型技术在Rh血型鉴定中的应用研究

目的研究聚合酶链式反应-特异性序列引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)基因分型技术在Rh血型鉴定中的应用。方法收集广东省肇庆市无偿捐血者RhD阴性血型样本2例、RhD阳性样本1例,采用盐水法进行C、c、D、E、e抗原分型,对D抗原阴性的样本采用抗人球蛋白法进行确认。提取样本基因组DNA,并应用PCR-SSP基因分型技术特异性扩增RhD以及RhCE基因片段,并对D外显子进行检测。根据有无PCR产物以及产物长度,判断样本的基因型。结果 1例RhD阳性样本以及ccdee样本的血清学分型与基因分型结果相符合,1例Ccdee样本的血清学分型与基因分型结果不相符。结论 PCR-SSP基因分型技术在RhD血型鉴定中能识别血清意义上的假阴型,在临床输血实践中具有广阔的应用前景。

应用分子生物学技术检测及蛋白质模型预测1例弱D型54

目的对1例血型血清学检测为RHD变异型的样本进行基因分型,并进行家系调查分析。方法运用血型血清学检测方法对先证者及其家系样本进行RHD确认及RH血型抗原表位检测,用序列特异性引物PCR(sequence specific primer PCR,PCR-SSP)法分析RHD基因外显子的表达,运用Sanger和SMRT(single molecule real-timesequencing)测序法对先证者及其家系样本进行RHD基因的1~10外显子测序分析。通过AlphaFold模拟构建蛋白质三级结构,将突变前后的蛋白质结构进行叠合以观察结构内分子间相互作用力的改变。结果先证者为RHD弱表型,其他抗原为Ccee,直接抗人球蛋白试验、抗体筛查、抗体鉴定试验均为阴性,PCR-SSP初步分型为RHD阳性。其父母血型血清学及PCR-SSP结果均为RHD阳性。SMRT测序结果显示先证者母亲为RHD^(+)/RHD^(-)杂合子。Sanger测序结果显示,先证者父亲携带弱D型54等位基因。AlphaFold建模预测揭示,p.Ser122Leu突变不能与146位GLU形成氢键相互作用。结论该样本为弱D型54,p.Ser122Leu突变导致氨基酸内部分子间作用力发生改变,从而引起突变后蛋白质结构和功能的部分改变。

温州苍南地区122例畲族MNS血型抗原和基因频率调查

目的:探讨温州苍南地区畲族人群MNS血型系统抗原和基因频率分布情况。方法:收集2021年10月至2022年4月温州医科大学附属苍南医院苍南地区122例畲族人群基本信息及外周血样,采用血清学方法鉴定MNS表现型,荧光聚合酶链反应-序列特异性引物法对MNS基因分型进行检测。结果:温州苍南地区畲族人群的MNS血型血清学定型与基因型结果一致。MNS血型系统的基因频率分别为:M=0.566、N=0.434、S=0.037、s=0.963。基因型MM、MN、NN的频率分别为0.254、0.123、0.623,基因型ss、Ss的频率分别为0.926、0.074,未检测到SS基因型。结论:温州苍南地区畲族人群MNS血型基因频率分布与报道的藏族、汉族其他人群分布相似又有差异,具有自身分布频率特点。