SRPK2的测序及分析

用 SRPK1有关的克隆 ,制备探针 ,并与人胎脑 c DNA文库进行筛查。测得 SRPK2 3.744 kb的核苷酸序列 ,并与 SRPK1比较。显示 SRPK2与 SRPK1的序列有 77%的相近 ,而在 SRPK1激酶区域有 90 %相似。从 SRPK2的氨基酸序列上看 ,其 NH2 端存在一段富含脯氨酸序列区。推测 SRPK2是 SRPK家族的新成员 ,SRPK2的 NH2 端的富含脯氨酸结构可使其具有独特的调节功能 。

SRPK1激活Wnt/β-catenin通路促进肝癌细胞上皮间充质转化

目的 探讨丝氨酸精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)对肝癌细胞株HepG2上皮间充质转化(EMT)的作用。方法 通过Ualcan及TIMER 2.0数据库分析SRPK1 mRNA在肝细胞癌(LIHC)与正常样本、配对癌旁样本之间的表达差异,与生存时间、临床分期、病理分期、TP53变异、人种、性别、年龄、体重等临床资料的关系。用HPA数据库的免疫组化数据验证SRPK1蛋白在LIHC组织及正常对照间的表达差异。构建SRPK1过表达及抑表达的HepG2细胞,并根据SRPK1表达差异分为SRPK1组及对照的Vector组,shRNA组及对照的Scramble组。Western blot检测4组细胞株SRPK1的蛋白水平。Western Blot、免疫荧光检测EMT分子标记物E-cadherin、Vimentin蛋白表达差异。核浆蛋白分离比较细胞β-catenin入核程度的变化。GEPIA2数据库分析在LIHC组织中SRPK1与Wnt/β-catenin通路下游基因Twist、MYC、MMP9的相关性,Real-time PCR验证SRPK1对Twist、MYC、MMP 9表达的影响。结果 SRPK1表达在LIHC组织中表达显著高于正常对照及配对癌旁样本(P<0.05),随疾病分期及病理分级增加而增加(P<0.05),高表达SRPK1组总生存期低于低表达组(P=0.035),LIHC患者TP53突变组SRPK1表达高于非突变组(P<0.05),在不同种族、性别、年龄、体重间无差别(P>0.05)。SRPK1过表达HepG2细胞E-cadherin表达下降,Vimentin表达增加(P<0.05);抑表达细胞E-cadherin增加,Vimentin下降(P<0.05)。SRPK1在LIHC组织中分别与Twist、MYC、MMP9表达呈正相关性(P<0.05);SRPK1过表达细胞β-catenin蛋白在细胞核中表达增加(P<0.05),Twist、MYC、MMP9表达增加(P<0.05);反之,抑表达细胞β-catenin在细胞核中表达下降(P<0.05),Twist、MYC、MMP9表达减少(P<0.05)。结论 SRPK1可能通过Wnt/β-catenin通路促进HepG2细胞EMT活化。

LRRK2基因Gly2385Arg多态性与泉州地区汉族人群散发性帕金森病的关联研究

目的探讨LRRK2基因Gly2385Arg同泉州地区汉族人群散发性帕金森病(PD)的关系。方法收集268例泉州地区汉族散发性PD患者和277例健康者的外周血液标本并提取DNA,利用聚合酶链反应(PCR)-限制性酶切方法(RFLP)进行LRRK2基因Gly2385Arg多态位点的基因型检测,变异者进行直接测序验证。结果 Gly2385Arg检测中,PD组有26例是杂合型变异(9.7%),显著高于对照组(2.2%;P<0.01,OR:4.85,95%CI:1.96～11.99)。按性别分层显示:在男性亚组或女性亚组中,Gly2385Arg变异的频率在PD组均分别显著高于健康对照组(男性亚组:P<0.01,OR:4.07,95%CI:1.32～12.54;女性亚组:P<0.01,OR:6.44,95%CI:1.39～29.72)。按起病年龄分层显示,晚发型PD(起病年龄>50岁)中,Gly2385Arg变异的频率显著高于对照组(P<0.01,OR:4.44,95%CI:1.63～12.06);早发型PD(起病年龄≤50岁)中,Gly2385Arg变异的频率与对照组差别无意义。结论 LRRK2基因Gly2385Arg多态是泉州地区汉族人群晚发型PD的一个风险因子。

丝氨酸-精氨酸蛋白激酶对剪接因子调节作用的研究

目的 研究丝氨酸 -精氨酸蛋白激酶 (Serine \arginineprotein -specifickinase,SRPK)对剪接子在哺乳动物细胞核内定位的调节作用。方法 转染SRPK1和SRPK2 的细胞系通过免疫荧光染色在显微镜下观察剪接因子在胞核内的定位。结果 在转染了SRPK1和SRPK2 的细胞中 ,SRPK1和SRPK2 的绿色荧光信号可见于胞浆及胞核中 ,剪接因子以核斑点的形式集中在未转染SRPK1和SRPK2 的细胞中 ,而弥散性分布于表达SRPK1和SRPK2 的细胞中。结论 SRPK家族蛋白激酶可调节剪接因子在核内的重新分布。

丝氨酸精氨酸蛋白激酶1在体外促进HepG2细胞干性的获得

目的研究丝氨酸精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)对肝癌细胞株HepG2肿瘤干性的作用。方法从GEPIA2数据库获得TCGA中关于肝细胞肝癌(LIHC)的数据,分析SRPK1表达在癌组织及正常样本的差异,以及与患者生存时间、临床分期的关系。采用TIMER数据库分析SRPK1表达与肝癌组织中浸润免疫细胞的相关性。构建SRPK1过表达和抑表达的HepG2稳转细胞株,并根据SRPK1表达差异分为SRPK1组及对照的Vector组,shRNA组及对照的Scramble组,Western blot检测4组细胞株SRPK1的蛋白水平。体外成球实验检测肿瘤细胞的成球能力,流式细胞术检测侧群(SP)细胞在细胞群中的比例。实时荧光定量PCR比较细胞肿瘤干性标记物Nanog、Oct4、CD133及Bmi1的mRNA水平。基因集合富集分析(GSEA)预测SRPK1与Wnt/β-catenin通路的相关程度。结果SRPK1表达在LIHC患者肿瘤组织中显著高于正常组织(P<0.05),在患者各个分期中表达有差异(P<0.05),高表达SRPK1患者生存率低于低表达SRPK1患者(P<0.05),肝癌组织中SRPK1与B细胞、CD8^(+)T细胞、CD4^(+)T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞的浸润水平均相关(P<0.05)。Western blot结果显示SRPK1组SRPK1蛋白相对表达量高于Vector组(P<0.01),shRNA组则低于Scramble组(P<0.01)。SRPK1组肿瘤细胞成球率(SFE)、SP细胞比例、Nanog、Oct4、CD133及Bmi1的mRNA相对表达量均高于Vector组(P<0.05),shRNA组低于Scramble组(P<0.05)。GSEA结果显示LIHC中SRPK1高表达与Wnt/β-catenin通路活化正相关(P<0.05)。结论SRPK1促进HepG2细胞肿瘤干性的获得。

丝氨酸/精氨酸蛋白特异性激酶-2在胃癌组织中的表达情况及临床意义

目的探讨丝氨酸/精氨酸蛋白特异性激酶-2(SRPK2)在胃癌组织中的表达情况与胃癌患者临床特征及预后的关系。方法收集胃癌患者经手术切除的胃癌组织及相应的癌旁组织标本各85例,采用免疫组织化学法检测SRPK2在85例胃癌患者胃癌组织及癌旁组织中的表达情况,分析胃癌组织中SRPK2阳性表达与胃癌患者临床特征及预后的关系。结果免疫组化染色结果显示,胃癌组织中SRPK2的阳性表达率明显高于癌旁组织(P<0.01)。浸润深度(根据T分期)为T3~4期、有淋巴结转移、肿瘤直径>5cm、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期胃癌患者胃癌组织中SRPK2的阳性表达率均高于浸润深度(根据T分期)为T1~2期、无淋巴结转移、肿瘤直径≤5cm、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期的胃癌患者,差异均有统计学意义(P<0.05);不同性别、年龄、肿瘤分化程度、肿瘤部位胃癌患者胃癌组织中SRPK2的阳性表达率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示,SRPK2阳性表达的胃癌患者的术后5年总生存率低于SRPK2阴性表达的胃癌患者(P<0.05)。结论SRPK2在胃癌组织中的阳性表达率较高,可能与胃癌的发生、发展有关。SRPK2阳性表达的胃癌患者的预后较差,其可能成为胃癌临床诊疗及预后评估的生物学标志物。

SRPK1促进肺腺癌进展的机制研究

目的探究丝氨酸-精氨酸蛋白激酶1(serine-arginine protein kinase 1,SRPK1)在肺腺癌中的表达及其促进肺腺癌恶性进展的机制。方法检索Human Protein Atlas数据库,比较SRPK1在正常肺组织和肺腺癌组织的表达水平;检索Kaplan Meier Plotter数据库,分析SRPK1的表达水平与肺腺癌患者生存预后的关系。采用慢病毒感染法在肺腺癌细胞A549、H1299中稳定过表达SRPK1,通过RT-qPCR和Western blot检测对照组和SRPK1过表达组细胞中SRPK1的表达水平。检索文献寻找SRPK1影响肿瘤进展的可能机制,通过Western blot检测对照组和SRPK1过表达组细胞中黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)及pFAK(Y397)的表达水平;检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中肺腺癌队列的RNA-Seq数据,对SRPK1和丝氨酸蛋白酶抑制剂mRNA结合蛋白1(serpine 1 mRNA binding protein 1,SERBP1)的表达进行皮尔森相关性分析。通过细胞免疫荧光实验鉴定A549和H1299细胞中SRPK1和SERBP1的共定位情况;通过co-IP实验鉴定A549和H1299细胞中SRPK1和SERBP1的结合情况;采用慢病毒感染法在A549和H1299中稳定过表达SERBP1,通过RT-qPCR和Western blot检测对照组和SERBP1过表达组细胞中SERBP1的表达水平;通过RT-qPCR检测对照组和SERBP1过表达组细胞中SRPK1的表达水平;通过Western blot检测对照组和SERBP1过表达组细胞中SRPK1、FAK、pFAK(Y397)的表达水平。结果Human Protein Atlas数据库的数据显示,与正常肺组织相比,肺腺癌组织中SRPK1表达明显上调;Kaplan Meier Plotter数据库中数据显示,SRPK1表达水平越高,肺腺癌患者的预后越差(P=1.5×10^(-8))。RT-qPCR和Western blot结果显示,与对照组相比,SRPK1过表达组细胞SRPK1的表达水平上调(P<0.001);Western blot结果显示,与对照组相比,SRPK1过表达组细胞中FAK的表达基本不变,pFAK(Y397)的表达上调。皮尔森相关性分析显示,在TCGA数据库的肺腺癌队列数据中,SERBP1的基因表达与SRPK1的基因表达呈正相关(P=2.2×10^(-16))。细胞免疫荧光结果显示,在A549和H1299细胞中SRPK1和SERBP1存在共定位;co-IP结果显示,在A549和H1299细胞中SRPK1和SERBP1可以相互结合;RT-qPCR结果显示,与对照组相比,SERBP1过表达组细胞SERBP1和SRPK1的表达水平均上调(P<0.01);Western blot结果显示,与对照组相比,SERBP1过表达组细胞中SRPK1表达上调,FAK的表达基本不变,pFAK(Y397)的表达上调。结论在肺腺癌细胞中,SRPK1的表达异常升高,并可通过激活磷酸化FAK信号促进肺腺癌的恶性进展,SERBP1可以结合SRPK1并调控上述过程。

丝氨酸—精氨酸蛋白激酶1在乳腺癌中的表达及意义

目的:探索丝氨酸—精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)在乳腺浸润癌中的表达以及与乳腺癌患者临床病理特征的关系,旨在为SRPK1作为乳腺癌的新型标志物提供理论依据。方法:通过UALCAN、TIMER、HPA等数据库分析SRPK1在不同肿瘤中的表达水平、在乳腺浸润癌(BRCA)与正常对照及配对癌旁样本之间的表达差异,同时分析SRPK1与BRCA临床资料的关系。通过TIMER数据库分析在BRCA中SRPK1与浸润免疫细胞的关系。通过STRING数据库,分析与SRPK1高相关蛋白。通过R语言分析TCGA数据库中与SRPK1高相关的基因。结果:SRPK1在多种肿瘤中高表达,BRCA组织中SRPK1的表达水平显著高于正常样本及对应癌旁组织(P<0.001)。在BRCA标本中,SRPK1表达水平与患者疾病分级(stage)、TNM分期和组织学亚型、淋巴结转移、癌症表型、TP53突变等均相关(P<0.05);SRPK1高表达患者总生存率低于低表达患者(P<0.05),SRPK1表达对BRCA诊断曲线下面积(AUC)=0.793(CI:0.757~0.829)。不同种族(race)、性别(gender)、绝经情况(menopausal status)等对SRPK1表达无影响,但(21~40岁)年龄组SRPK1表达高于其他高年龄组(P<0.05)。SRPK1表达在乳腺癌组织中与多种免疫细胞的浸润水平均显著相关(P<0.05)。STRING工具分析SRPK1蛋白的PPI网络,与SRPK1正相关性较高的基因为:BIRC5、AQP9、BCL2A1;负相关性较高的基因为:NAT1、ADH1B。结论:SRPK1在BRCA中高表达并预示不良预后,可作为BRCA的潜在的标志物。

小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2基因真核重组表达质粒的构建及其对微管蛋白聚合的影响

目的构建小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,SRPK2)基因(srpk2)的真核重组表达质粒,并分析其对微管蛋白α-Tubulin聚合的影响。方法利用RT-PCR法扩增srpk2的全长cDNA序列,通过分子克隆技术构建真核重组表达质粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2;在脂质体Lipofectamine 2000的介导下,将真核重组表达质粒及空载体pLV-EGFP2(A)Puro分别转染人胚肾HEK293T细胞,同时设空白对照组(未转染)。采用RT-PCR及Western blot法分别检测HEK293T细胞中srpk2基因mRNA转录及SRPK2蛋白的表达情况;Western blot法分析HEK293T细胞中聚合态和游离态α-Tubulin的含量。结果双酶切及DNA序列鉴定证明真核重组表达质粒pLV-EGFP2(A)Puro-srpk2构建正确,且在HEK293T细胞中实现了srpk2基因过表达。真核重组表达质粒转染组HEK293T细胞中游离态α-Tubulin含量显著低于空载体转染组及空白对照组(P<0.05),而聚合态α-Tubulin水平明显高于空载体转染组及空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了srpk2基因的真核重组表达质粒,SRPK2可促进α-Tubulin微管蛋白聚合。

微小RNA-149-5p调控丝氨酸-精氨酸蛋白激酶1基因对肾癌细胞侵袭、迁移的影响

目的探讨肿瘤抑制因子微小RNA(miRNA,miR)-149-5p对肾癌细胞转移潜能的影响及机制。方法GRC-1细胞分成miR-149-5p组(转染miR-149-5p mimics)、miR-NC组(转染mimics control)、miR-149-5p+丝氨酸-精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)组(共转染miR-149-5p mimics、pcDNA3.1-SRPK1)、miR-149-5p+vector组(共转染miR-149-5p mimics、pcDNA3.1)。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-149-5p水平,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移能力变化,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白水平。利用在线靶基因预测软件发现SRPK1可能是miR-149-5p的靶基因,双荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。应用SPSS 21.0统计软件分析。结果miR-149-5p组的GRC-1细胞中miR-149-5p(2.69±0.27比1.01±0.08)和E-cadherin(0.81±0.09比0.42±0.05)水平显著高于miR-NC组,侵袭数目[(70.81±6.35)个比(110.64±9.67)个]、迁移数目[(108.46±9.27)个比(162.76±12.71)个]、N-cadherin(0.46±0.05比0.79±0.11)和SRPK1(0.45±0.06比0.92±0.08)蛋白水平显著低于miR-NC组,差异均有统计学意义(FmiR-149-5p=95.385,F侵袭数目=20.216,F迁移数目=22.010,FN-cadherin=15.100,FE-cadherin=31.331,FSRPK1=31.785,P<0.05)。共转染SRPK1野生型质粒的miR-149-5p组细胞荧光素酶活性(0.37±0.04比1.00±0.11)显著低于miR-NC组,差异有统计学意义(t=16.150,P<0.05)。共转染SRPK1突变型质粒的miR-149-5p组细胞荧光素酶活性(0.99±0.10比1.00±0.09)与miR-NC组比较差异无统计学意义(t=0.220,P>0.05)。miR-149-5p+SRPK1组的GRC-1细胞中E-cadherin(0.45±0.04比0.80±0.08)水平显著低于miR-149-5p+vector组,侵袭数目[(99.51±7.48)个比(71.84±5.37)个]、迁移数目[(145.06±11.14)个比(107.63±10.20)个]、N-cadherin(0.86±0.10比0.47±0.04)和SRPK1(0.89±0.06比0.50±0.07)蛋白水平显著高于miR-149-5p+vector组,差异均有统计学意义(tSRPK1=7.327,t侵袭数目=5.205,t迁移数目=4.292,tN-cadherin=6.272,tE-cadherin=6.778,P<0.05)。结论肿瘤抑制因子miR-149-5p靶向负调控SRPK1表达降低肾癌细胞的迁移和侵袭能力。

丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2基因真核表达质粒的构建及其对HeLa细胞增殖和凋亡的影响

目的构建小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,SRPK2)基因真核表达质粒,建立稳定过表达SRPK2的He La细胞系,并探讨SRPK2过表达对He La细胞增殖和凋亡的影响。方法利用RT-PCR从小鼠睾丸组织中扩增SRPK2基因,与p3×Flag-CMV-14质粒连接,构建重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-14-SRPK2,转染He La细胞,通过G418筛选获得稳定转染细胞系。采用RT-PCR检测稳定转染He La细胞系中SRPK2基因的转录,Western blot检测SRPK2的表达;MTT法和流式细胞术分别检测SRPK2过表达对He La细胞增殖和凋亡的影响。结果菌落PCR、双酶切及DNA测序表明重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-14-SRPK2构建正确;RT-PCR和Western blot分析表明SRPK2基因在He La细胞中稳定过表达;p3×Flag-CMV-14-SRPK2稳定转染组细胞增殖活力明显高于p3×Flag-CMV-14转染组和未转染组(P<0.05),细胞凋亡率明显低于上述两组(P<0.05)。结论成功构建了SRPK2基因的真核表达质粒,建立了稳定过表达SRPK2的He La细胞系,SRPK2过表达可增强He La细胞的增殖活力,而抑制其凋亡。

SRPK1基因对膀胱癌细胞生物学行为的影响及机制研究

目的观察丝氨酸/精氨酸蛋白特异性激酶1(SRPK1)对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并进一步探究其分子机制。方法利用Oncomine癌症数据库分析SRPK1基因在膀胱癌组织及正常膀胱组织中的表达;构建SRPK1特异的慢病毒干扰质粒(sh1和sh2)和阴性对照质粒(NC),包装慢病毒颗粒,分别感染T24细胞和5637细胞。设空白对照组(T24和5637)、阴性对照组(T24/NC和5637/NC)、干扰组1(T24/sh1和5637/sh1)和干扰组2(T24/sh2和5637/sh2);采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞中SRPK1 mRNA和蛋白水平的表达变化;采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力的变化;采用Transwell细胞迁移和侵袭实验检测各组细胞迁移和侵袭能力的变化;采用Western blot检测各组细胞上皮间质转化(EMT)及AKT通路相关蛋白表达变化。结果Oncomine癌症数据库中SRPK1 mRNA在膀胱癌组织中的表达明显高于正常膀胱组织(P<0.001)。通过qRT-PCR和Western blot检测结果显示病毒感染后的细胞SPRK1在mRNA和蛋白水平均明显下调;在慢病毒感染后的T24细胞中,第3~5天干扰组的吸光度值均低于阴性对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);在慢病毒感染后的5637细胞中,第2~5天干扰组的吸光度值均低于阴性对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);Transwell细胞迁移和侵袭实验显示:与阴性对照组比较,干扰组的迁移和侵袭的膀胱癌细胞数目均明显减少,差异均有统计学意义(均P<0.05);Western blot结果显示,与阴性对照组比较,干扰组的E-cadherin表达量增加,而N-cadherin和vimentin的表达明显减少,同时AKT通路蛋白p-AKT及p-GSK3β明显下调,差异均有统计学意义(P<0.001)。结论SRPK1基因在膀胱癌组织中高表达,下调SRPK1的表达可抑制膀胱癌细胞的增殖,并降低膀胱癌细胞的侵袭和迁移能力。