重组截短型人角质细胞生长因子1在昆虫细胞中的表达

目的:探讨重组截短型人角质细胞生长因子1(rhKGF1D23)蛋白在昆虫细胞中表达的可行性,为rhKGF1D23蛋白的生产提供新的途径。方法:PCR法扩增昆虫偏爱密码子优化截短序列kgf1d23亚克隆到pFastbac载体。在辅助质粒的作用下,pFastBac-kgf1d23载体Tn7片段转座到Bacmid中mini-attTn7位点,得到穿梭载体Bacmid-kgf1d23,并通过脂质体法转染sf-9细胞得到杆状病毒P1。继续转染细胞扩增病毒并提高病毒滴度,蛋白表达分析从P3代病毒转染细胞开始,收集细胞超声裂解后进行纯化,MTT法检测纯化后目的蛋白生物活性。结果:昆虫偏好密码子改造的kgf1d23基因构建进转移载体pFastBac-kgf1d23和穿梭载体Bacmid-kgf1d23载体中。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在60h后开始大量表达,优化的收获蛋白时间在84～96h;利用肝素亲和层析和SP阳离子交换层析可以去除90%以上的杂蛋白。纯化的rhKGF1D23蛋白在0.3～25.0μg.L-1时,随浓度的增加HaCat细胞的促有丝分裂能力增强,在25.0μg.L-1时达到平台期。结论:重组截短型角质细胞生长因子rhKGF1D23蛋白在昆虫细胞中得到表达,保持其特有的肝素亲和特性,并具有免疫原性及细胞生物学活性。