shRNAmir慢病毒载体沉默环氧合酶-2对鼻咽癌细胞放疗敏感性的影响

目的探讨COX-2基因沉默对鼻咽癌C666-1细胞放射敏感性的影响。方法以稳定沉默COX-2基因表达的鼻咽癌Anti-COX-2 C666-1细胞和对照细胞Anti-GL-2 C666-1为研究对象,采用克隆形成实验及曲线拟合计算不同剂量辐射后各放射生物学参数和放射增敏比;采用流式细胞仪检测辐射后细胞周期的变化;采用体内荷瘤裸鼠动物模型检测放疗后皮高下,放移射植增瘤敏的比生为长曲1.4线01,4并;C计O算X抑-2瘤沉率默。后结降果低了An辐ti-射CO诱X导-2的C6G662-/1M细期胞阻S滞F2、,D并0增、D加q值辐较射对后照荷组瘤均裸明鼠显的偏抑低瘤,α率/β。显结著增论COX-2基因稳定沉默后可改变鼻咽癌C666-1的放射生物学参数,并降低辐射引起的G2/M期阻滞,增大抑瘤率,能够起到放疗增敏的作用。

shRNAmir慢病毒载体沉默鼻咽癌细胞中环氧合酶-2的表达

目的构建基于miR-155结构的shRNAmir慢病毒表达载体,在鼻咽癌细胞中沉默COX-2基因的表达,探索全新的COX-2抑制方法。方法转染小干扰RNA(siRNA),筛选出沉默COX-2表达的RNA干扰序列,以该序列替换miR-155前体序列中的双链部分作为anti-COX-2 shRNAmir转录模板,构建pLVTHM/shRNAmir慢病毒质粒表达载体,利用293FT细胞包装pLVTHM/anti-COX-2shRNAmir慢病毒。感染鼻咽癌C666-1细胞后,通过流式分选,建立anti-COX-2 shRNAmir稳定表达,COX-2基因沉默的亚系。结果设计合成的anti-COX-2a siRNA能够使COX-2 mRNA表达下降90%以上,根据其序列构建的pLVTHM/shRNAmir质粒载体测序无误,pLVTHM/anti-COX-2 shRNAmir慢病毒感染C666-1细胞后,分选出亚系C666-1经反复传代仍可保持COX-2基因沉默的表型。结论pLVTHM/shRNAmir慢病毒载体能够转录出基于miR-155结构的shRNAmir,沉默鼻咽癌细胞COX-2的表达,为探索更加高效安全的COX-2抑制剂奠定基础,也为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新手段。

RNAi的触发机制及其在哺乳动物基因功能分析中的应用

RNAi是外源和内源性dsRNA在细胞内诱导具有同源序列的基因瞬时或稳定表达抑制的现象,是一种在实验室中进行基因功能分析的强大工具。本文将对RNAi的触发机制、哺乳动物细胞内触发RNAi的3种触发子(siRNA、shRNA、shRNAmir)及RNAi在基因功能分析中的研究进展作一综述。

光诱导RNAi系统的构建及优化

利用光诱导基因表达系统,构建光诱导RNAi系统,并对系统转染比例、转录因子的表达量和shRNAmir表达载体的核心启动子进行优化。通过构建不同启动子的光敏转录因子GAVPO表达载体和不同核心启动子的shRNAmir表达载体,分析它们对报告基因的干扰效果的影响。结果表明,GAVPO的表达量对报告基因沉默效果和shRNAmir的背景表达水平至关重要。低表达量的GAVPO能够实现对报告基因的微调控,报告基因的表达量下降到约60%;而高表达量的GAVPO能够高效抑制报告基因表达,报告基因的表达量下降到34%。