沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞生长及其趋化效应的影响

目的构建大鼠趋化因子CX3C的配体1(chemokine CX3C ligand 1,CX3CL1)基因慢病毒RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,观测其沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,b MSCs)生长及其趋化效应的影响。方法首先分离、培养大鼠骨髓b MSCs,并予以流式细胞术检测鉴定。针对CX3CL1基因mRNA序列,筛选3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点并予以合成。把合成的siRNA导入b MSCs,Western blot检测其对靶基因编码蛋白的抑制效应,以此明确最佳siRNA。设计与合成针对最佳siRNA序列的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA),连入CD513B-1慢病毒载体,构建CD513B-1/CX3CL1 shRNA慢病毒,并行测序鉴定。测序正确者用293T细胞包装成具有高效感染力的CD513B-1/CX3CL1 shRNA重组慢病毒,该重组病毒用于感染b MSCs。分离培养大鼠脾巨噬细胞,将其与被感染的b MSCs共培养。倒置显微镜下观测被感染b MSCs的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;CCK-8检测被感染b MSCs的生长变化;Real-time PCR检测被感染b MSCs的CX3CL1与核抗原PCNA基因的表达变化;Western blot检测被感染b MSCs的CX3CL1和PCNA蛋白,与被感染的b MSCs共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF和IL-8的表达变化。结果大鼠b MSCs得以分离、培养和鉴定。筛检得CX3CL1基因的最佳干扰序列:CTCTATGAGCAATTATTTA;测序证实,成功构建重组慢病毒载体CD513B-1/CX3CL1 shRNA。荧光观察表明,被CD513B-1/CX3CL1shRNA病毒感染的b MSCs明显表达GFP。CCK-8检测结果显示,与对照细胞比较,沉默CX3CL1的b MSCs的生长减慢,48 h开始更为明显(P<0.01);Real-time PCR、Western blot检测结果证实,CX3CL1基因的shRNA慢病毒能有效沉默b MSCs的CX3CL1,并下调其核抗原基因PCNA及其蛋白的表达,沉默CX3CL1的b MSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达。结论成功构建CX3CL1基因RNAi重组慢病毒载体。该病毒载体能有效沉默b MSCs的CX3CL1基因,使b MSCs的生长减慢并下调其核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达。沉默CX3CL1的b MSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达。

人三叶因子3 shRNA表达质粒的构建及有效序列筛选

目的：三叶因子3（trefoil factor 3,TFF3）除具有黏膜保护作用外还与恶性肿瘤的形成、生长、转移有关。本研究通过慢病毒表达质粒介导shRNA,瞬时转染自身表达TFF3的甲状腺乳头状癌K1细胞,筛选出了靶向人TFF3的最有效的siRNA序列。方法：分别在人TFF3基因mRNA的132、170、258和537bp处作为潜在靶位点,合成4条siRNA转录模板的发夹结构（shRNA1-4）以及1条阴性对照（shRNAC）,体外退火后插入pLVX-shRNA-puro构建重组质粒,酶切鉴定,并测序。瞬时转染K1细胞、Real-time PCR及western-blot等检测TFF3mRNA和蛋白在转染细胞的表达。结果：shRNA 1-2两条发夹结构序列有基因突变,shRNA 3-4对K1细胞TFF3表达有不同程度的抑制效应（P〈0.01）。其中shRNA3（TFF3 258-276）表现出了最高的沉默效率（转染效率76.83%时,mRNA水平的沉默效率达60.67%;蛋白质水平的沉默效率达56.44%,均P〈0.01）。结论：成功构建了pLVX-shRNA-puro-TFF3慢病毒质粒,并筛选出了最有效的序列,为进一步研究TFF3的功能奠定了基础。