PLCε siRNA转染对膀胱癌细胞株T24侵袭能力的影响

目的:研究磷脂酶C-ε(Phospholipase C epsilon,PLCε)siRNA表达质粒的转染对人膀胱癌细胞系T24侵袭转移能力的影响。方法:分别将携有PLCεsiRNA基因的真核表达质粒两对p11-PLCε和p12-PLCε载体体外转染T24细胞,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PLCεmRNA的表达情况,应用Transwell小室侵袭试验、明胶酶谱分析分别研究转染前、后膀胱癌细胞侵袭转移能力的变化,并以空载质粒HK-A转染和未转染细胞为对照。结果:RT-PCR检测显示pll-PLCε,p12-PLCε转染成功后T24细胞PLCεmRNA表达明显比空质粒HK-A转染和未转染细胞减弱;p12-PLCεsiRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(26.8±5.8)和pll-PLCεsiRNA转染细胞穿透侵袭小室滤膜的数目(25.8±6.2)明显少于未转染细胞(34.8±6.9)和HK-A转染细胞(33.8±5.7)(P<0.01);明胶酶谱分析显示转染pll-PLCε、p12-PLCε均使细胞分泌MMP-2、MMP-9明显低于未转染细胞和HK-A转染细胞。结论:推测转染外源性PLCεsiRNA基因能下调PLCε基因的表达并能抑制膀胱癌细胞侵袭转移。

马立克氏病病毒超强毒UL49基因siRNA表达质粒的构建与鉴定

以马立克氏病病毒超强毒(RB1B株)UL49为靶基因,利用计算机辅助设计UL49基因特异的siRNA,再定向克隆至pSilencerTM2.1U6neovector载体中构建siRNA表达重组体,转化DH5α菌株,提取质粒酶切鉴定后,进行测序分析,证实为所需序列。以上结果表明,针对马立克氏病超强毒UL49基因的siRNA表达质粒已构建成功。

ABCE1基因siRNA表达质粒的构建及在95-D肺腺癌细胞中的表达

目的构建针对人ABCE1基因siRNA表达质粒,为进一步研究该基因功能奠定基础。方法合成含靶向ABCE1基因siRNA转录模板的茎环结构,与两端分别有BamHⅠ、HindⅢ酶切位点的RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express质粒连接,大肠杆菌中扩增,测序鉴定,转染到95-D肺腺癌细胞中,观察其表达。结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,重组质粒电泳初步说明质粒构建成功,测序结果表明RNAi-ReadypSIREN-DNR-DsRed-Express的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ之间有71bp的插入片段,其序列与所设计、合成的ABCE1的siRNA转录模板序列一致,该质粒转染到95-D细胞中表达为红色荧光蛋白。结论 siRNA转录模板完整正确地插入RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中。

存活素siRNA表达质粒mU6/survivin的抑癌机制研究

目的:在本课题组报导存活素siRNA表达质粒(mU6/survivin质粒)能高效剔降乳腺癌细胞MCF-7中存活素表达的基础上,进一步探讨其抑癌机制。方法:采用MTT法、流式细胞术、Hoechst细胞形态染色和Western blotting等检测mU6/survivin质粒对乳腺癌MCF-7细胞多项生物学指标的影响。结果:mU6/survivin质粒作用后,MCF-7细胞的增殖明显地受到抑制;细胞周期被阻滞在G1期,细胞呈现多核化、巨核化;caspase-3被激活,表达升高;IκBα、Cyt C和P21WAF1蛋白表达升高,NF-κB(p65)蛋白表达无明显改变。结论:mU6/survivin质粒沉默MCF-7细胞中存活素表达后,DNA受损细胞停滞在G1期,细胞增殖受到抑制,此过程与Caspase级联放大、线粒体凋亡通路以及细胞周期调控等有关。细胞逃逸有丝分裂关卡的检查,阻断有丝分裂导致的细胞裂亡是其死亡的主要方式。

insig-1基因siRNA干扰质粒的构建及对炎症状态下细胞胆固醇代谢的影响

目的构建针对insig-1基因的siRNA表达载体,观察其对炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇代谢的影响。方法根据insig-1核苷酸序列,设计并构建针对insig-1基因mRNA的3个特异性siRNA表达载体(si-1、si-2、si-3)和1个无同源性的阴性对照载体(si-nc),经酶切和测序鉴定确认siRNA载体构建成功后,转染RAW264.7小鼠巨噬细胞,RT-PCR、免疫组化法检测insig-1基因的表达,筛选出最佳抑制基因后,应用酶学方法和油红O染色观察炎症处理后RAW264.7细胞内胆固醇含量的变化。结果经酶切证实,siRNA表达载体构建成功,RT-PCR、Western blot、免疫组化法显示与未转染组相比,si-1、si-2、si-3组RAW264.7细胞中insig-1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),其中si-2干扰效果最强。酶学方法和油红O染色结果表明,炎症状态下细胞insig-1沉默后胆固醇的含量和油红O颗粒增多。结论成功构建了insig-1基因siRNA干扰质粒,insig-1缺失对炎症状态下细胞胆固醇摄取有促进作用。

人TGF-β_2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。

Sox9、siRNA表达载体的构建与鉴定

目的构建Sox9siRNA表达载体,分析Sox9在软骨肉瘤中的作用机制。方法根据KouI,IkegawaS提供的Sox9mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSilencer质粒中,并对重组质粒(命名为pSilencer/Sox9siRNA)进行酶切及测序鉴定。结果双酶切证实Sox9siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论成功构建Sox9siRNA表达载体。

抑制人PC4基因表达的siRNA载体的构建与筛选

目的构建和筛选能高效、特异性抑制人转录辅助调控因子4(positive coactivator 4,PC4)基因表达的siRNA载体。方法设计并合成人PC4基因特异性的4对siRNA干扰靶点,分别克隆入pSES-HUS腺病毒穿梭质粒,构建重组pSES-HUS-PCi1,pSES-HUS-PCi2,pSES-HUS-PCi3和pSES-HUS-PCi4质粒。使用脂质体包裹,瞬时转染293T细胞,qRT-PCR和Western blot检测其对PC4 mRNA和蛋白表达的影响,筛选最佳的重组质粒及干扰靶点,同时探讨其对上皮来源的293T细胞增殖和迁徙的影响。结果构建的4对重组质粒载体经酶切鉴定和基因测序分析,其基因大小、序列与预期相符。将4对重组质粒及pSES-HUS空质粒瞬时转染293T细胞,发现pSES-HUS-PCi1重组质粒组较pSES-HUS空质粒组和正常293T细胞组中PC4 mRNA和蛋白的表达低,且差异具有统计学意义(P<0.01)。可见pSES-HUS-PCi1重组质粒的PC4靶点序列(正义,5'-AACAGAGCAGCAGCAGCAGATTTT-3’;反义,5'-ATCTGCTGCTGCTGCTCTGTTTT-3')能抑制PC4mRNA的表达和蛋白的合成,其抑制率分别是85.30%和80.57%。干扰PC4表达后293T细胞的体外增殖和迁徙能力下降,且以pSES-HUS-PCi1重组质粒组最为明显(P<0.05)。结论成功构建并筛选出高效、特异性抑制PC4表达的siRNA载体,并发现PC4能影响上皮来源293T细胞的增殖和迁徙能力。

livinβ-siRNA表达载体的构建及其在人星形胶质瘤细胞中的稳定表达

目的构建livinβ-siRNA表达载体,并观察其在人星形胶质瘤细胞(U251)中对livinβ基因表达的抑制。方法根据livinβ序列设计2条livinβ-siRNA特异性序列,PCR扩增方法合成2条siRNA链,与质粒pGenesil-11重组构建livinβ-siRNA表达载体,脂质体法转染人星形胶质瘤细胞(U251),RT-PCR和Western blot检测细胞中livinβ基因及蛋白表达。结果对重组质粒的双酶切鉴定和测序结果证明,livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA构建成功;RT-PCR检测转染组细胞中livinβmRNA表达水平明显低于对照组及空载体组,Western blot检测转染组细胞中livin蛋白表达水平明显低于对照组及空载体组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功构建了livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA,并且该载体能在真核细胞人星形胶质瘤细胞(U251)中稳定表达,并能抑制livinβ基因表达。

H-2K^d基因siRNA表达质粒的构建及在小鼠LAK细胞的表达

目的构建针对BALB/C小鼠H-2Kd基因siRNA表达质粒,观察其在小鼠LAK细胞的表达,为进一步研究H-2Kd基因功能奠定基础。方法设计siRNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,通过与线性化的pSi-lencer 3.0-H1连接,转化大肠杆菌DH5a扩增纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。采用siRNA表达质粒封闭小鼠LAK细胞MHC-I(H-2Kd)的表达,同时设空转染组和无关序列组,流式细胞术检测不同组别靶蛋白的表达。结果纯化的质粒分子量为2.8 Kb,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符,流式细胞术检测证实siRNA能够抑制靶蛋白的表达。结论成功构建了针对H-2Kd基因的siRNA表达质粒并抑制了其表达。

环氧合酶-2特异性siRNA真核表达质粒对HT-29细胞生长的影响

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达质粒对人结肠癌HT-29细胞COX-2表达和生长的影响。方法设计短发夹结构的COX-2 siRNA对应模版DNA序列,构建重组质粒pshCOX-2。将重组质粒转染人结肠癌HT-29细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测COX-2表达。用四氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪观察COX-2表达被抑制后细胞的生长情况,放射免疫法(RIA)和ELISA法分别检测培养上清中PGE2和VEGF的含量变化。结果酶切及测序证实质粒pshCOX-2构建成功。转染重组质粒72h后可以显著抑制HT-29细胞COX-2 mRNA和蛋白表达(P<0.05),细胞生长受抑,凋亡细胞数显著增加(P<0.05),细胞PGE2和VEGF的产生受抑制(P<0.05)。结论成功构建的COX-2 siRNA真核表达质粒pshCOX-2通过抑制人结肠癌HT-29细胞COX-2基因表达,从而抑制细胞生长、PGE2合成和VEGF的产生。

存活素siRNA表达质粒对化疗药物抑癌作用的影响

目的探讨存活素si RNA表达质粒(mU6/survivin质粒)对化疗药物抑癌作用的影响。方法采用MTT法检测mU6/survivin质粒与多种常规肿瘤化疗药物对乳腺癌MCF-7细胞增殖的联合作用。结果比较单纯化疗药物作用组的各相应浓度点,si RNA表达质粒mU6/survivin与化疗药物顺铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶或秋水仙碱合用组对肿瘤细胞MCF-7的细胞增殖抑制率均明显提高,差异均有统计学意义(P<0.01);对靶向DNA药物如顺铂、环磷酰胺和5-氟尿嘧啶的抗癌性能具有显著的协同增强作用(二者合用效应Q值均>1),但对靶向微管的药物秋水仙碱没有相加作用(Q值<1)。结论在解除肿瘤细胞中存活素功能的基础上进行药物化疗,可能是肿瘤治疗的一个新的可行方向。

卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建和鉴定大鼠卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC)胸腺嘧啶核苷酸合酶(Thymidylate synthase,TS)基因的siRNA(Short interfering RNA)表达载体。方法:人工合成针对PCTS基因的1对shRNA(Short hairpin RNA)序列并定向克隆到空载体pTZU6+1上,构建siRNA表达重组质粒pPC-TS,并采用双酶切产物凝胶电泳和基因测序法鉴定。结果:酶切电泳和基因测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。结论:成功构建卡氏肺孢子胸腺嘧啶核苷酸合酶基因siRNA表达载体。

抑制Coronin-1基因表达的siRNA载体的构建和筛选

目的:构建和筛选能高效、特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体。方法:提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,克隆入pSEB-HUS真核表达质粒,构建pSEB-HUS-C重组质粒。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-HUS-C,构建重组pSEB-HUS-C1、pSEB-HUS-C2、pSEB-HUS-C3及pSEB-HUS-CN质粒。将干涉质粒瞬时转染A549细胞,通过绿色荧光信号观察、实时定量PCR和Western blot法检测其对Coro-nin-1基因表达的影响。结果:经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。经瞬时转染A549细胞后,其中的pSEB-HUS-C3能明显抑制Coronin-1 mRNA的表达和Coronin-1蛋白的合成,抑制率分别是75.9%和75.1%。结论:成功构建并筛选出高效、特异性抑制Coro-nin-1表达的siRNA表达载体,为进一步研究Coronin-1在巨噬细胞中的作用奠定基础。

卡氏肺孢子表面糖蛋白siRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建和鉴定卡氏肺孢子(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surfce glycoprotein,MSG)基因短干扰性RNA(short interfering RNA,siRNA)表达载体。方法:设计并人工合成针对PC MSG基因的短发夹状(Short hairpin RNA,shRNA)序列并定向克隆到siRNA表达载体pTZU6+1上,采用双酶切后凝胶电泳与DNA测序法进行鉴定。结果:酶切和测序鉴定得到的产物与预期目的基因一致。结论:成功构建卡氏肺孢子主要表面糖蛋白基因siRNA表达载体。

INTU-siRNA质粒的构建及在人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞中的筛选

目的:构建人源靶向特异INTU-si RNA质粒,转染人源性甲状腺Nthy-ori-3-1细胞以构建INTU基因沉默的Nthy-ori-3-1细胞模型,为探索Graves病的发病机制提供合适的细胞模型。方法:构建四对人源INTU序列(编号分别为INTU-29、INTU-31、INTU-33、INTU-35)si RNA质粒和空载体质粒,将空载体和四对INTU-si RNA质粒分别转染Nthy-ori-3-1细胞培养24 h,通过倒置荧光显微镜观察质粒转染细胞后的荧光表达,使用多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光定量PCR法验证INTU基因的沉默效率,通过蛋白质免疫印迹法验证各组细胞内INTU蛋白的表达水平,筛选沉默INTU基因效率最佳的质粒。结果:空载体和INTU-si RNA质粒转染入Nthy-ori-3-1细胞24 h后,倒置荧光显微镜和荧光酶标仪检测结果显示空载体和四组INTU-si RNA组呈现绿色的荧光表达,与正常组相比,空载体与四组INTU-si RNA组的荧光强度均显著高于正常组(P<0.01),提示质粒均转染成功。荧光定量PCR结果显示,与正常组和空载体组相比,四组INTU-si RNA组的INTU基因m RNA相对表达量均显著降低(P<0.01),其中INTU-35组表达降低最显著,INTU的m RNA表达降低了61.02%。蛋白质免疫印迹法结果显示,与正常组和空载体相比,INTU-29组和INTU-31组并无显著降低,INTU-33和INTU-35组较正常组和空载体组明显下降(P<0.05,P<0.01),其中INTU-35组最佳,INTU的蛋白表达降低了44.54%。以上结果提示INTU-35组沉默INTU基因效果最佳。结论:本研究成功构建INTU-si RNA质粒,并将该质粒成功转染人源甲状腺Nthy-ori-3-1的细胞模型。INTU-si RNA甲状腺细胞模型的构建,为进一步探索Graves病的发病机制奠定了实验基础。

PLK1基因沉默对K562/A02细胞周期、增殖和耐药性的影响

为了探讨小干扰RNA(siRNA)对K562/A02细胞Polo样激酶1(PLK1)基因的抑制作用及其对细胞周期、细胞增殖和耐药性的影响,将构建的针对PLK1mRNA的siRNA真核质粒,导入K562/A02细胞,用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在转染前后的表达差异;台盼蓝拒染试验检测细胞存活率;流式细胞术(FACS)检测细胞周期和细胞内阿霉素(ADM)的积累量;MTT试验检测细胞对ADM的药物敏感性。结果显示,与对照组相比,转染24和48小时后,siRNA-PLK1质粒转染组的PLK1mRNA下降(34.7±2.1)%和(56.6±1.5)%,蛋白水平下降(49.9±3.2)%和(62.1±1.7)%;转染24和48小时后,细胞存活率下降了30%和59%;转染48小时后,G2/M期细胞比例提高了2.77倍,同时细胞内ADM积累量显著提高;对ADM药物敏感性的相对率为73.8%。结论:PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02细胞生长,使细胞周期停滞在G2/M期,同时使得细胞内ADM积累量提高,对ADM敏感性增强。

hTERT干扰真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)干扰真核表达载体。方法人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到siRNA(small interfereace RNA)真核表达载体pSilencer3.1_H1neo;采用PCR、酶切和测序鉴定。结果成功构建了hTERT干扰真核表达载体。结论hTERT干扰真核表达载体的构建为进一步研究端粒、端粒酶在肿瘤细胞中的生物学作用奠定了基础。

绵羊ApoER2基因克隆及其干扰质粒对睾丸共培养细胞硒蛋白表达的影响

本研究旨在克隆绵羊ApoER2基因,构建ApoER2-siRNA质粒载体,研究ApoER2基因沉默对睾丸共培养细胞SelP和PHGPx表达的影响。利用RT-PCR技术,克隆ApoER2序列,在此基础上构建4种pGPU6/GFP/Neo—ApoER2-siRNA质粒表达载体,利用脂质体将其转染到体外共培养绵羊睾丸细胞中,采用Real—time PCR和Western blotting方法,检测其抑制效应,并研究ApoER2基因沉默对Sel P和PHGPx mRNA表达的影响。本研究成功获得了长度为2 490 bp的绵羊睾丸ApoER2完整编码区序列,共编码892个氨基酸,绵羊ApoER2核苷酸序列与牛的同源性最高,相似性为97.7%。ApoER2-siRNA-1565和ApoER2-siRNA-2567位点重组质粒的干扰效果较好(P<0.01),选取ApoER2-siRNA-2567重组质粒,结果显示转染组Sel P和PHGPx表达量显著降低(P<0.01)。获得了绵羊ApoER2编码区序列和有效抑制该基因表达的2个质粒载体,ApoER2沉默可能影响了睾丸硒蛋白Sel P和PHGPx的表达,为进一步研究ApoER2转运硒机理提供了理论依据。