盐芥miRNA393沉默载体的构建

将与内源mRNA编码区同源的小片段外源双链RNA导入细胞中,通过一系列细胞内反应引发细胞中相应mRNA降解,可导致特定基因表达沉默。通过PCR扩出与miRNA399互补的IPS,并改造成与miRNA393互补的IPS′,测序正确后酶切连入3301H载体转化盐芥。

人SIRT2基因结构和功能的生物信息分析及原核表达

目的:通过生物信息学方法预测和分析人沉默信息调节因子2(Silent Information Regulator 2,SIRT2)基因结构和功能,利用分子生物学方法构建SIRT2重组质粒并进行原核表达。方法:利用NCBI、STRING、ProtParam、Genecards和SWISS-MODEL等软件和数据库对SIRT2蛋白的理化性质、跨膜结构域、亚细胞定位、翻译后修饰、二级结构、三级结构及相互作用网络等生物学特性进行了预测分析,采用PCR扩增技术获得SIRT2基因的cDNA序列全长,通过同源重组的方法构建p ET-28aSIRT2重组表达质粒并进行原核表达。结果:人SIRT2蛋白由389个氨基酸组成,是一种呈酸性、不稳定的、亲水的胞内蛋白质。SIRT2主要分布在细胞质,具有38个潜在的磷酸化修饰位点,其二级结构主要是无规则卷曲。成功构建了重组质粒p ET-28aSIRT2,并通过IPTG诱导大肠杆菌BL21后成功获得SIRT2蛋白的表达,SIRT2主要存在于细菌裂解液离心之后的沉淀中。结论:本研究成功克隆了人SIRT2的编码区,结合多种生物信息软件对SIRT2的性质和功能进行了了解,为进一步研究SIRT2蛋白的生物学功能和肿瘤的靶向治疗作用机制提供思路。

SIRT1及其突变体T200I、E420K真核表达载体的构建及鉴定

目的 克隆沉默信息调节因子1（SIRTl）基因的全长cDNA,构建含有SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的重组真核表达载体,为进一步研究SIRT1基因功能奠定基础.方法 采用RT-PCR方法扩增SIRT1基因的全长cDNA,扩增产物通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,得到pcDNA3.1 （＋）-SIRT1重组质粒;同时采用定点突变法构建其突变体pcDNA3.1 （＋）-T200I和pcDNA3.1（＋）-E420K表达载体.重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测定,筛选出重组成功的真核表达载体.结果 成功克隆了SIRT1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1 （＋）-SIRT1及其突变体的真核表达载体;阳性重组质粒酶切后经测序比对鉴定,与预期序列完全相符,转染293T细胞后可以表达带有HIS标签的SIRT1蛋白.结论 此方法可成功构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-SIRT1及其突变体pcDNA3.1（＋）-T200I、pcDNA3.1（＋）-E420K真核表达载体,为SIRT1基因及其突变体T200I、E420K的生物学功能研究提供了基因材料.