人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)在转基因家蚕丝腺中的特异表达

家蚕丝腺具有强大合成与分泌蛋白质的能力,利用其作为生物反应器生产高附加值外源蛋白有着广阔的市场前景。以人血白细胞基因组DNA为模板,扩增并克隆了人脑源性神经营养因子基因(hBDNF)核苷酸序列。序列分析表明,克隆的hBDNF核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号:NM_170735)的同源性为100%。随后采用家蚕丝胶基因(Ser1)启动子,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,将hBDNF构建到piggyBac转座表达载体并注射入家蚕早期胚胎,在G1代筛选获得了54头转基因阳性个体。经分子检测证实,hBDNF已整合到家蚕基因组并在丝腺有较高水平的特异表达。

piggyBac转座子介导的转基因家蚕丝腺生物反应器研究进展

综述了基于piggyBac转座子的转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的3个关键环节:(1)外源目的基因高效插入家蚕基因组;(2)转基因家蚕的高效、快捷的检测;(3)具有生物活性的外源目的蛋白的高效表达和纯化。同时介绍了有关转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白的研究进展,为更好地利用转基因家蚕丝腺生物反应器表达外源蛋白提供了参考。

家蚕丝腺生物反应器表达狂犬病病毒核蛋白

【目的】采用家蚕丝腺生物反应器这一蛋白高效表达系统,尝试建立一种高效、低廉、稳定生产狂犬病病毒核蛋白(RVNP)的技术体系,为生产基因工程疫苗奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法克隆获得RVNP序列,采用家蚕丝胶蛋白基因(Ser1)启动子为特异性启动子,将RVNP构建到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记基因的piggyBac转座子表达载体(pBA3EGFP)中,并采用显微注射转基因家蚕技术构建家蚕丝腺生物反应器。【结果】G1代通过EGFP标记的筛选获得转基因家蚕阳性蛾区26个,蛾圈阳性率为59.09%。PCR实验证实RVNP已经整合到家蚕基因组中,Western blot分析表明RVNP蛋白可能附着于丝胶蛋白并随家蚕吐丝行为分泌到蚕茧中。【结论】获得了能够表达外源的RVNP蛋白的转基因家蚕品系,该系统有望成为高效、低廉、稳定地生产狂犬病基因工程疫苗的技术体系之一。

转基因家蚕丝腺生物反应器体系的建立和应用

数千年来,家蚕的主要经济价值在于生产蚕丝,以此形成的蚕丝产业为人类经济发展和社会进步做出了卓越贡献。随着现代生物技术的快速发展,特别是在家蚕基因组计划以及家蚕功能基因组研究平台建立的促进下,家蚕丝腺高效合成与分泌丝蛋白的这一奇特现象逐渐被了解和重视,以家蚕丝腺作为生物反应器大规模、低成本生产高附加值有用蛋白质的应用潜力也逐步得以彰显,并有可能成为促进传统蚕丝产业改造及拓宽产业领域的重要方向之一。本文综合分析了过去10年国内外在家蚕丝腺生物反应器领域的发展线索及取得的研究成果,并就该领域的现存问题与发展趋势进行了初步分析和讨论。

家蚕生物反应器的研究进展及开发前景

目前 ,家蚕生物反应器的研究和开发主要是以BmNPV为载体 ,在家蚕体液中表达多种有用蛋白 ,其表达量比其它生化微生物高出许多倍 ;但是家蚕绢丝腺细胞表达外源蛋白比家蚕BmNPV表达系统有着更大的优越性。

家蚕生物反应器的研究概述

家蚕生物反应器在生产活性成分、表达外源基因、改善蚕丝性能等方面,具有很高的开发利用价值。本文概述了家蚕幼虫反应器、家蚕NPV表达系统反应器、转基因家蚕反应器、家蚕丝腺反应器的研究状况。

酵母和人剪接因子Prp5在家蚕中部丝腺的表达

剪接因子Prp5是一种三磷酸腺苷（ATP）水解酶/RNA解旋酶,在内含子的识别和预剪接体的组装过程中具有重要的调控作用。分别克隆了酵母（Saccharomyces cerevisiae）与人（Homo sapiens）Prp5蛋白的核心编码序列Sc Prp5-M和h Prp5-M,然后在序列上游分别添加8×His标签序列,再与转基因质粒p Bac-Seri1-IE1ds Red（含seri1基因启动子和信号肽序列）进行重组,得到p Bac-Sc Prp5-M和p Bac-h Prp5-M转基因质粒。利用家蚕转基因技术将转基因质粒分别注射到蚕卵中,通过串联红色荧光标记筛选阳性转基因家蚕,在基因组水平检测到有Sc Prp5-M和h Prp5-M插入的家蚕个体,进一步的RNA和蛋白质检测也证明2种外源蛋白在家蚕中部丝腺中特异性表达,并且在5龄第4天和第5天的表达量较高。此外,在家蚕中部丝腺表达的2种重组蛋白均能随丝蛋白分泌到体外存在于茧层中,经裂解和纯化后,每1 g鲜茧茧层可分别获得6.25μg重组Sc Prp5-M蛋白和12.5μg重组h Prp5-M蛋白。利用家蚕丝腺生物反应器表达外源Prp5蛋白,为进一步研究Prp5蛋白的功能奠定了一定的实验基础。

家蚕丝腺生物反应器的研究进展

由于家蚕丝腺出色的蛋白合成能力,加之蚕丝蛋白成分相对简单以及家蚕幼虫易于室内饲养和基因工程操作,其作为生物反应器在实验室水平和产业化应用层面都受到越来越广泛的应用。家蚕丝腺生物反应器主要是利用家蚕丝腺的蛋白质高效合成能力进行外援蛋白的生产。家蚕生物反应器是一种真核表达系统,具有表达成本低及表达产物活性高的优势,其不仅在开发新型茧丝复合材料方面有着得天独厚的优势,随着生物技术的进展,其在表达有用活性蛋白方面也得到越来越广泛的应用。家蚕生物反应器主要分为家蚕丝腺生物反应器和家蚕杆状病毒表达系统。主要对家蚕丝腺生物反应器的研究进展进行了综述,提出其中存在的问题。

利用转基因家蚕丝腺生物反应器生产重组蛋白的应用前景

家蚕丝腺拥有较强合成丝蛋白的能力,通过利用这一能力,使其能够大量生产有价值的蛋白,人们开始引入转基因家蚕,使它能够在丝腺中合成重组蛋白并分泌到蚕茧中。获得的重组蛋白可在生物学、生物技术,和药学领域中得到广泛应用。我们通过控制合成蛋白在丝腺中的定位,在后部丝腺(PSG)中表达重组蛋白使其定位在不能溶解的丝素中,在中部丝腺(MSG)中表达则定位于亲水外层的丝胶层中。本文主要讨论将转基因家蚕丝腺生物反应器作为优良工具,应用于大量生产药用蛋白和在工业化水平生产相关重组蛋白的可能性,以及生产重组蛋白过程中所面临的挑战和未来的应用前景。

探索转基因生物反应器的新途径

近年来乳腺反应器带来的商业化成品越来越多,这似乎预示着融入转基因技术的生物反应器已经发展到了最佳阶段,但就高度分化的细胞组织而言,外源基因表达的有限性会在一定程度上抑制生物反应器合成更多的人造蛋白质。因此用不同生物反应器的生理机制去构建多元复合蛋白合成体系将会变得愈发重要。以探索生物反应器开发新途径为目的,本文多从基本理论观点出发结合现代前沿反应器实际应用特点,描述构建简单生命代谢系统的现状,并将相对而言发展较为成熟的乳腺反应器作为比较对象,试说明使用高度非分化的卵细胞和能产生结构蛋白的丝腺作为生物反应器的潜在优势。文章最后根据市场需求与技术本身的创新点提出展望。