基于显微操作的单细胞分选方法

本文利用激光共聚焦显微镜成像清晰的优势,结合显微操作系统,将视野下看到的目的细胞直接用微吸管挑选出来,实现单细胞分选等功能。由于是在可视条件下进行的分选,细胞分选纯度可达100%。本方法是一种适用于样品量少、样品组成复杂、需要特性表达分选或定位分选的单细胞分选方法。

利用胎儿血红蛋白表型分选、检测母血中胎儿有核红细胞

目的:建立高纯度、高得率、高特异性的分选技术,富集纯化母血中胎儿有核红细胞(FNRBC).方法:70例孕妇外周血,经密度梯度离心初步富集后行血红蛋白γ链免疫组化染色,以显微操作术挑取阳性细胞.采用单细胞PEP-PCR技术检测SRY基因,并进行荧光原位杂交分析.结果:胎儿NRBC具有鲜明的形态学、免疫学特征.每例母血FNRBC数5～27个,平均0.82±0.37/ml.PEP-PCR检测的灵敏度、特异度分别为95.35%、100%.4例FISH结果均与实际核型相符.结论:以γ-血红蛋白为分选标志,结合显微操作技术,可以有效地获取高纯度、高浓度研究模板,保证后继分析的准确性,为无创性产前诊断发展奠定基础.

3种碱性染液对显微捕获联合低体积扩增技术的影响

目的:比较3种碱性染液对显微捕获联合低体积扩增(Lowvolume polymerase chain reaction,LVPCR)技术的影响,为细胞分离检验中细胞核标记物的选择提供依据。方法:显微捕获联合LVPCR中,用苏木素、龙胆紫、亚甲基蓝3种染液对口腔上皮细胞进行标识。参照龙胆紫染色法,比较0.5、1、2、5、8μl苏木素染液及2、5、8、10、15μl亚甲基蓝染液的染色效果,优化染色条件;并比较优化后的细胞核标识效果。显微操作仪捕获3种染液染色后的细胞进行DNA检验,比较检测结果;并捕获染色10、30、60 min口腔上皮细胞,比较染色时间对DNA检测结果的影响。结果:100μl口腔上皮细胞悬液加入2μl苏木素、0.5μl龙胆紫或5μl亚甲基蓝染液,细胞核均着色明显,与胞浆对比清晰。5个细胞的分离检验结果示有效分型率分别为90%、100%、66.7%,成功分型率为20%、100%、11.1%;龙胆紫、苏木素染色时间(≤60 min)对DNA检测结果无明显影响,而亚甲基蓝染色时间延长导致等位基因丢失等现象加重,影响检测结果。结论:3种染液均可清晰标识细胞核;而龙胆紫染液对LVPCR技术抑制最弱,为三者中较优的细胞核标记物。

龙胆紫染色法在显微捕获单细胞分离技术中的应用

目的建立用于显微捕获单细胞技术的龙胆紫染色法并评价其应用效果。方法制作20枚口腔拭子脱落细胞悬液,配制0.05g/mL龙胆紫染液。取100μL口腔细胞悬液加入0.15、0.25、0.5、1.0、2.0μL染色液,考察最佳染色浓度;分别染色5、10、30、60min,考察最佳染色时间;用最佳条件染色后抓捕3个细胞,采用联合LV-PCR技术扩增并进行DNA分型检测,进行重复试验20次,并对同一检材未经染色的抓捕细胞进行检测,用于比对STR分型成功率。将龙胆紫染色法用于案例检材的口腔上皮细胞分离检验。结果 100μL细胞悬液加入0.5μL 0.05g/mL龙胆紫染液,染色5min,胞核呈紫红色,与胞浆对比明显;染色时间延长不影响染色效果及细胞分离检验结果。优化后的龙胆紫染色法对低体积扩增无明显抑制(P>0.05)。应用此染色法于案例检材,胞核标识清晰,STR分型结果达同一认定标准。结论龙胆紫染色法利于细胞核的发现,有助于提高显微捕获单细胞技术的检测效能。