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Construction of single chain Fv antibody against transferrin receptor and its protein fusion with alkaline phosphatase 被引量:12
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作者 Dao-FengYang Hui-FenZhu +2 位作者 Zhi-HuaWang Guan-XinShen De-YingTian 《World Journal of Gastroenterology》 SCIE CAS CSCD 2005年第21期3300-3303,共4页
AIM: To construct fusion protein of a single-chain antibody (scFv) against transferrin receptor (TfR) with alkaline phosphatase(AP). METHODS: The VH-linker-VL,namely scFv gene,was prepared by amplifying the VH and VL ... AIM: To construct fusion protein of a single-chain antibody (scFv) against transferrin receptor (TfR) with alkaline phosphatase(AP). METHODS: The VH-linker-VL,namely scFv gene,was prepared by amplifying the VH and VL genes from plasmid pGEM-T-VH and pGEM-T-VL with splicing overlap extension polymerase chain reaction (SOE PCR). After the ScFv gene was modified by 5/71 and Not I,it was subcloned into the secretory expression vector pUC19/119, and then was transformed into E.coli TG1.The positive colonies were screened by colony PCR and their expressions were induced by IPTG.ScFv gene was gained by digesting ScFv expression vector pUC19/119 with 5/71 and NotI restriction enzymes, then subcloned into expression vector pDAP2, followed by transformation in E.coli TG1.The positive colonies were selected by bacterial colony PCR.The expression of fusion protein (scFv-AP) was induced by IPTG.Its activity was detected by enzyme immunoassay. The molecular weights of scFv and scFv-AP were measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). RESULTS: The product of SOE PCR formed a band of 700 bp in agarose gel electrophoresis. SDS-PAGE demonstrated the molecular weight of scFv was 27 ku.Immunofluorescent assay (IFA) demonstrated its reactivity with TfR.The molecular weight of scFv-AP was 75 ku.Enzyme immunoassay showed that scFv-AP could specifically bind to human TfR and play AP activity. CONCLUSION: We have successfully prepared the anti-human TfR scFv and constructed the fusion protein of scFv and AP.It is promising for immunological experiments. 展开更多
关键词 Transferrin receptor Fusion protein single chain fv antibody Alkaline phosphatase Primary hepatocarcinoma
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Antioxidant Effect of Human Selenium-containing Single-chain Fv in Rat Cardiac Myocytes 被引量:8
2
作者 HUO Rui SHI Yi +10 位作者 XU Jun-jie YAN Fei LV Shao-wu SU Jia-ming DUAN Yu-jing FAN Jia NING Bo CONG Deng-li YAN Gang-lin LUO Gui-min WEI Jing-yan 《Chemical Research in Chinese Universities》 SCIE CAS CSCD 2009年第2期216-219,共4页
Reactive oxygen species(ROS) plays a key role in human heart diseases. Glutathione peroxidase(GPX) functions as an antioxidant as it catalyzes the reduction of hydroperoxide. In order to investigate the antioxidan... Reactive oxygen species(ROS) plays a key role in human heart diseases. Glutathione peroxidase(GPX) functions as an antioxidant as it catalyzes the reduction of hydroperoxide. In order to investigate the antioxidant effect of human selenium-containing single-chain Fv(Se-scFv-B3), a new mimic of GPX, a model system of hydrogen peroxide(H202)-induced rat cardiac myocyte damage was established. The cardiac myocyte damage was characte- rized in terms of cell viability, lipid peroxidation, cell membrane integrity, and intracellular H202 level. The Se-scFv-B3 significantly reduced H2O2-induced cell damage as shown by the increase of cell viability, the decline of malondialdehyde(MDA) production, lactate dehydrogenase(LDH) release, and intracellular H2O2 level. So Se-scFv-B3 may have a great potential in the treatment of human heart diseases induced by ROS. 展开更多
关键词 Human single-chain fv SELENIUM Glutathione peroxidase H202 Cardiac myocyte
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Construction and Analysis of Three-dimensional Graphic Model of Single-chain Fv Derived from an Anti-human Placental Acidic Isoferritin Monoclonal Antibody by Computer 被引量:3
3
作者 周春 沈关心 +4 位作者 朱慧芬 杨静 张悦 冯健南 沈倍奋 《Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences)》 SCIE CAS 2000年第1期23-25,共3页
Summary: A three-dimensional (3D) graphic model of a single-chain Fv (scFv) which was derived from an anti-human placental acidic isoferritin (PAF) monoclonal antibody (MAb) was construct- ed by a homologous protein... Summary: A three-dimensional (3D) graphic model of a single-chain Fv (scFv) which was derived from an anti-human placental acidic isoferritin (PAF) monoclonal antibody (MAb) was construct- ed by a homologous protein-predicting computer algorithm on Silicon graphic computer station. The structure, surface static electricity and hydrophobicity of scFv were investigated. Computer graphic modelling indicated that all regions of scFv including the linker, variable regions of the heavy (VH) and light (VL) chains were suitable. The VH region and the VL region were involved in composing the 'hydrophobic pocket'. The linker was drifted away VH and VL regions. The complementarity determining regions (CDRs) of VH and VL regions surrounded the 'hydrophobic pocket'. This study provides a theory basis for improving antibody affinity, investigating antibody structure and analyzing the functions of VH and VL regions in antibody activity. 展开更多
关键词 placental acidic isoferritin single-chain fv three-dimensional structure com- puter modelling
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Novel Selenium-containing Human Single-chain Variable Fragment with Glutathione Peroxidase Activity from Computer-aided Molecular Design 被引量:1
4
作者 WANG Cheng WAN Pei +9 位作者 GONG Ping-sheng LV Li-min XU Ya-wei ZHAO Yang HE Bo ZHAO Gang YAN Gang-lin MU Ying LV Shao-wu LUO Gui-min 《Chemical Research in Chinese Universities》 SCIE CAS CSCD 2011年第5期813-819,共7页
In order to enhance the glutathione peroxidase(GPX) catalytic activity of the selenium-containing single-chain variable fragments(Se-scFv), a novel human scFv was designed on the basis of the structure of human an... In order to enhance the glutathione peroxidase(GPX) catalytic activity of the selenium-containing single-chain variable fragments(Se-scFv), a novel human scFv was designed on the basis of the structure of human antibody and optimized via bioinformatics methods such as homologous sequence analysis, three-dimensional(3D) model building, binding-site analysis and docking. The DNA sequence of the new human scFv was synthesized and cloned into the expression vector pET22b(+), then the scFv protein was expressed in soluble form in Escherichia coli BL21(DE3) and purified by Ni2+-immobilized metal affinity chromatography(IMAC). The serine residue of scFv in the active site was converted into selenocysteine(Sec) with the chemical modification method, thus, the human Se-scFv with GPX activity was obtained. The GPX activity of the Se-scFv protein was characterized. Compared with other Se-scFv, the new human Se-scFv showed similar efficiency for catalyzing the reduction of hydrogen peroxide by glutathione. It exhibited pH and temperature dependent catalytic activity and a typical ping-pong kinetic mechanism. 展开更多
关键词 Glutathione peroxidase(GPX) single-chain variable fragment(scfv Three-dimensional model SELENIUM
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抗汉滩病毒NP抗原mAb的ScFv-C_κ基因真核和原核表达载体的构建及鉴定 被引量:2
5
作者 阎岩 徐志凯 +6 位作者 胡刚 白文涛 罗雯 吴兴安 张芳琳 刘勇 王海涛 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期171-174,共4页
目的构建抗汉滩病毒HTNVNP抗原mAb的ScFvCκ基因原核和真核表达载体。方法将鼠源性抗HTNVmAb1A8的ScFv基因和人Cκ基因连接,分别克隆入原核表达载体pComb3和真核表达载体pCIneo中,并用间接免疫荧光和Westernblot检测其原核表达产... 目的构建抗汉滩病毒HTNVNP抗原mAb的ScFvCκ基因原核和真核表达载体。方法将鼠源性抗HTNVmAb1A8的ScFv基因和人Cκ基因连接,分别克隆入原核表达载体pComb3和真核表达载体pCIneo中,并用间接免疫荧光和Westernblot检测其原核表达产物的活性。结果成功地构建了重组1A8ScFvCκ基因并克隆入原核和真核表达载体。间接免疫荧光和Westernblot分析表明,该基因在E.coliTG1中的表达产物可与HTNVNP抗原特异性结合。结论抗NP抗原mAb的ScFvCκ原核和真核表达载体的构建,为进一步研究细胞内抗体的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 单链抗体 单克隆抗体 汉滩病毒 NP抗原 真核表达 原核表达 载体构建
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抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv(3G11)在大肠杆菌的表达及其抗肿瘤活性 被引量:10
6
作者 苗庆芳 尚伯杨 +1 位作者 李亮 甄永苏 《医学研究杂志》 2007年第2期25-29,共5页
目的制备抗IV型胶原酶单链抗体(scFv),用于构建小型化抗肿瘤抗体靶向药物。方法构建重组表达质粒pET-scFv,并在大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,分步透析复性。ELISA法、免疫细胞化学染色法检测scFv... 目的制备抗IV型胶原酶单链抗体(scFv),用于构建小型化抗肿瘤抗体靶向药物。方法构建重组表达质粒pET-scFv,并在大肠杆菌进行诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot法对表达蛋白进行鉴定,分步透析复性。ELISA法、免疫细胞化学染色法检测scFv对靶抗原和肿瘤细胞的结合活性,明胶酶谱法检测对IV型胶原酶活性的抑制作用。Boyden Chamber法测定对肿瘤细胞侵袭的影响。动物试验肿瘤模型检测在小鼠体内的抗肿瘤活性。结果表达的单链抗体scFv(3G11)以包涵体的形式存在,经变性和复性后,对抗原IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应呈阳性,抗体亲和常数为6×107/mol/L。不仅可以抑制HT-29细胞和HT-1080细胞分泌的Ⅳ型胶原酶活性,还可以体外抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制程度与浓度呈剂量依赖关系。scFv(3G11)4mg/kg对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤率为49.4%(P<0.01)。结论scFv(3G11)保留了完整抗体的抗原结合和抑制活性,能够与肿瘤细胞特异性结合,并在小鼠体内有中度抑瘤效果。scFv(3G11)的相对分子质量远小于完整抗体,可作为肿瘤靶向药物的理想载体。 展开更多
关键词 Ⅳ型胶原酶 单链抗体 大肠杆菌 表达 活性
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抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFv-M97基因克隆及分泌性表达 被引量:8
7
作者 周春水 江敏 +1 位作者 徐琳娜 甄永苏 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期81-88,共8页
目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。... 目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体。结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732bp。其中V_H351bp,编码117个氨基酸;V_L336bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gl_(y_4)Ser)_3相连。阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20h,培养液上清中有2μg/ml可溶性单链抗体。免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力。结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 单链fv抗体 基因克隆 表达 肿瘤侵袭 肿瘤转移
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重链可变区基因随机CDR3 ScFv噬菌体抗体库的构建及筛选 被引量:2
8
作者 阎岩 白文涛 +5 位作者 徐志凯 罗雯 张芳琳 吴兴安 刘勇 王海涛 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第2期171-173,共3页
目的构建VH 基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库 ,并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH 基因 ,并与1A8VL 基因共同克隆入噬菌粒表达载体 pHEN1后 ,构建VH 基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬... 目的构建VH 基因随机CDR3ScFv噬菌体抗体库 ,并筛选抗HFRS病毒NP抗原的噬菌体抗体。方法采用随机引物PCR法扩增抗HFRS病毒mAb1A8的VH 基因 ,并与1A8VL 基因共同克隆入噬菌粒表达载体 pHEN1后 ,构建VH 基因随机CDR3ScFv基因库。继用辅噬菌体VCSM13超感染后得到噬菌体抗体库 ,然后用HFRS病毒抗原进行筛选。随机挑取筛选的菌落超感染 ,用夹心ELISA检测超感染上清。结果获得库容量约为107 噬菌体抗体库。夹心ELISA的结果表明 ,筛选出的噬菌体抗体可与HFRS病毒NP抗原特异性结合。结论成功地构建了库容量较高的ScFv噬菌体抗体库 ,并获得可与HFRS病毒NP抗原结合的噬菌体抗体。 展开更多
关键词 单链抗体 噬菌体抗体库 构建 HFRSV 亲和力 筛选
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抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达 被引量:2
9
作者 付建芳 黄威权 +1 位作者 夏永娟 杨安钢 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期735-738,共4页
目的:克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法:从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA,利用RT-PCR技术,克隆该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-AL1,转... 目的:克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法:从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA,利用RT-PCR技术,克隆该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-AL1,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果:VH基因序列全长369碱基对,编码123个氨基酸,VL基因序列全长339碱基对,编码113个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FRs)、3个抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力。结论:成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中,为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。 展开更多
关键词 溶藻弧菌 单链抗体 基因工程疫苗
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人源抗破伤风毒素单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及功能鉴定 被引量:2
10
作者 熊颖 李晓进 +3 位作者 乔玉玲 毛晓燕 龟井优德 赵红 《微生物学免疫学进展》 2009年第4期4-7,共4页
实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(G6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv。经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6。将ScFv-G6连接转化PET/26b质粒,... 实验通过DNA重组技术从一株可中和破伤风毒素的人源单克隆抗体细胞(G6)中扩增出了抗体VH、VL的基因,通过重叠PCR使连接片段与VH、VL连接成单链ScFv。经测序证实VH、VL为抗体的可变区序列,命名为ScFv-G6。将ScFv-G6连接转化PET/26b质粒,构建了抗体的表达载体,被命名为PET/26b/ScFv-G6。以该载体在大肠杆菌中分泌表达产物经Ni-亲和柱纯化后的小鼠试验证实,可抵抗破伤风毒素的攻击,表明为中和抗体。具有组织穿透力强,不易过敏,可直接靶向于毒素等特点,适合于破伤风的防治,具有重要的应用价值。 展开更多
关键词 单链抗体 原核表达 中和活性
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HBscFv毕赤酵母工程菌的中试发酵及产物纯化 被引量:1
11
作者 熊盛 谢秋玲 +2 位作者 王一飞 邓宁 粟宽源 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第1期79-83,共5页
中试规模生产可溶性重组人抗HBsAg单链抗体 (HBscFv) ,分泌表达HBscFv的巴氏毕赤酵母 (P .pastoris)工程菌在 30L发酵罐中进行补料分批培养 .上清中的HBscFv以离子交换及免疫亲和层析两步法进行纯化 .发现酵母工程菌经 7d补料分批培养后... 中试规模生产可溶性重组人抗HBsAg单链抗体 (HBscFv) ,分泌表达HBscFv的巴氏毕赤酵母 (P .pastoris)工程菌在 30L发酵罐中进行补料分批培养 .上清中的HBscFv以离子交换及免疫亲和层析两步法进行纯化 .发现酵母工程菌经 7d补料分批培养后 ,6 0 0nm波长下的光密度值 (OD6 0 0 )达到 334,目的蛋白表达量为 2 6 0mg/L .纯化后 ,可获得纯度为95 %的HBscFv ,产量为 171mg/L .活性测定结果表明 ,HBscFv制品的比活性为 (2 5 2±0 17) μg- 1,与大肠杆菌来源的HBscFv无明显差异 . 展开更多
关键词 乙肝表面抗原 单链抗体 巴氏毕赤酵母 发酵 纯化
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抗人肝癌MDscFV基因的表达及其免疫活性初步研究 被引量:1
12
作者 陆东东 张锡然 《临床肝胆病杂志》 CAS 北大核心 2003年第5期302-303,共2页
将抗人肝癌单克隆抗体MD的重链可变区VH和轻链可变区VL基因重组,并使其表达。采用PT-PCR技术扩增VH及VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建加MDscFV基因,经过常规转化与筛选,诱导表达蛋白。MDscFV基因全长为7... 将抗人肝癌单克隆抗体MD的重链可变区VH和轻链可变区VL基因重组,并使其表达。采用PT-PCR技术扩增VH及VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建加MDscFV基因,经过常规转化与筛选,诱导表达蛋白。MDscFV基因全长为732bp,VH354bp位于上游;VL330bp位于下游。重组蛋白相对分子量36kDa。scFV保留了与亲本抗体MD相似的免疫活性。成功地构建了抗人单链抗体MDscFV,并获得了较高水平的功能性表达。 展开更多
关键词 人肝癌 MDscfv基因 基因表达 免疫活性 基因重组 单克隆抗体MD
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Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达
13
作者 杨章民 孔令洪 +2 位作者 来宝长 王一理 司履生 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期542-544,548,共4页
目的 构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法 采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础... 目的 构建anti CD3scFv B7.1真核表达载体 ,并进行初步表达。方法 采用重叠延伸拼接法 (splicingbyoverlapextention ,SOE)将anti CD3scFv和B7.1(V +C)两个基因片段通过spacer序列连接 ,将融合基因克隆入T载体 ,并测序证实。在此基础上构建真核表达载体pcDNA/anti CD3scFv B7.1,并经脂质体法转染COS 7细胞 ,免疫组织化学法检测表达。结果 获得了序列与预期完全相同的融合基因 ;构建了抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ;在COS 7细胞中获得初步表达。结论 成功构建及表达抗CD3scFv B7.1融合基因真核表达载体 ,为进一步研究抗CD3scFv B7. 展开更多
关键词 Anti-CD3 scfv-B7.1 COS-7细胞 抗CD3单链抗体 基因表达 肿瘤 生物治疗 真核表达载体
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抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达
14
作者 代维 刘静 +5 位作者 黄鹤 文雪 袁晓梅 雷萍 朱慧芬 沈关心 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期936-939,共4页
目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达。方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamHⅠ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP... 目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达。方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamHⅠ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性。结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合。结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性。 展开更多
关键词 转铁蛋白受体 单链抗体 重叠延伸PCR
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抗汉滩病毒单抗3G1 scFv植物表达载体的构建 被引量:1
15
作者 罗雯 张九东 +3 位作者 白文涛 吴兴安 胡刚 张芳琳 《西安联合大学学报》 2004年第5期5-7,共3页
利用PCR方法,从含有3G1scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点.将其克隆入植物表达载体pBI121,构建获得3G1scFv pBI121重组质粒.酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功.将重组植物表达载体转入... 利用PCR方法,从含有3G1scFv基因的重组质粒中扩增出抗体基因,并使基因两端携带合适的限制性酶切位点.将其克隆入植物表达载体pBI121,构建获得3G1scFv pBI121重组质粒.酶切鉴定及测序结果均证明重组质粒构建成功.将重组植物表达载体转入农杆菌LBA4404,为进一步构建转基因植物的研究奠定了基础. 展开更多
关键词 汉滩病毒 单链抗体 植物表达载体
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抗CD3 scFv基因的真核表达及其生物学活性鉴定
16
作者 杨章民 胡劲松 +2 位作者 来宝长 王一理 司履生 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期552-555,共4页
目的 :真核表达抗CD3单链抗体 (scFv) ,并研究其生物学活性。方法 :将编码抗CD3scFv的DNA片段插入真核表达载体pDisplay中。对所构建重组表达载体进行测序确认后 ,以电穿孔法将重组质粒导入Hela细胞 ,以原位杂交法检测抗CD3scFv的表达 ,... 目的 :真核表达抗CD3单链抗体 (scFv) ,并研究其生物学活性。方法 :将编码抗CD3scFv的DNA片段插入真核表达载体pDisplay中。对所构建重组表达载体进行测序确认后 ,以电穿孔法将重组质粒导入Hela细胞 ,以原位杂交法检测抗CD3scFv的表达 ,以3 HTdR掺入法检测其在体外对T细胞的活化作用 ,以MTT比色法观察转染的Hela细胞与T细胞混合培养后 ,诱发的细胞毒性T细胞的杀伤作用。结果 :成功地构建了抗CD3scFv的真核表达载体 ,并在Hela细胞中获得表达。所分泌的抗CD3scFv在抗CD2 8mAb存在的条件下 ,能够刺激T细胞活化。将转染的Hela细胞与T细胞混合培养能够诱发CTL的杀伤作用。结论 :真核表达的抗CD3scFv具有刺激T细胞活化的活性 。 展开更多
关键词 抗CD3 scfv 真核表达 生物学活性
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抗乙型肝炎表面抗原单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及鉴定
17
作者 雷清 刘鹏 +1 位作者 郭敏 蒋琳 《微生物学免疫学进展》 2008年第4期36-39,共4页
从抗HBsAg鼠单抗的杂交瘤细胞提取RNA,经反转录得到cDNA,进一步扩增得到鼠重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),按VH-linker-VL的结构将VH、VL基因拼接成单链抗体(scFv)基因;经测序正确后进一步构建了表达重组体p26HBSc并在E.coli... 从抗HBsAg鼠单抗的杂交瘤细胞提取RNA,经反转录得到cDNA,进一步扩增得到鼠重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),按VH-linker-VL的结构将VH、VL基因拼接成单链抗体(scFv)基因;经测序正确后进一步构建了表达重组体p26HBSc并在E.coli中表达,得到一约30kD的外源蛋白;纯化后经ELISA检测与HBsAg有较高的亲和力活性,为下一步的人源化改造奠定了基础。 展开更多
关键词 单链抗体 连接肽 基因表达
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超抗原葡萄球菌肠毒素与抗人大肠癌单链抗体ND-1 scFv融合基因的构建、表达及活性分析
18
作者 陈航 李莉 方瑾 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期400-403,共4页
目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。N... 目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化。间接免疫荧光法检测融合蛋白的靶向结合活性,MTT法检测靶向杀伤效率。结果:成功构建了融合基因ND-1scFv/SEA,实现功能性表达,纯化的ND-1scFv/SEA融合蛋白与表达有ND-1相应抗原的大肠癌细胞CCL-187有高度亲和活性,通过激活外周血单核细胞,可特异性杀伤靶细胞,在4μg/mL浓度下对CCL-187的杀伤率达到91%,明显优于SEA的杀伤活性。结论:融合蛋白ND-1 scFv/SEA对大肠癌细胞CCL-187具有靶向结合和杀伤活性,为SEA用于靶向性的大肠癌治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 ND-1单克隆抗体 单链抗体fv 葡萄球菌肠毒素A 大肠癌
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B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70的制备及其抗瘤效应
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作者 叶庆 王志华 +3 位作者 秦叔逵 周红艳 邓昊 沈关心 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第2期133-138,共6页
背景与目的:恶性B型淋巴细胞表面免疫球蛋白(surface membrane immunoglobulin,SmIg)表达的独特型决定簇(Idiotypic determinant,Id)不仅是该类肿瘤特异性标记,也是该类肿瘤的特异性抗原,可诱导机体对其产生特异性免疫应答,但由于Id是... 背景与目的:恶性B型淋巴细胞表面免疫球蛋白(surface membrane immunoglobulin,SmIg)表达的独特型决定簇(Idiotypic determinant,Id)不仅是该类肿瘤特异性标记,也是该类肿瘤的特异性抗原,可诱导机体对其产生特异性免疫应答,但由于Id是自体成分,分子量小,免疫原性较弱。人热休克蛋白70(heat shock protein,Hsp70)是一类重要的抗原提呈分子,能有效加强抗原肽的免疫原性。本研究通过制备慢性B型淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphatic leukemia,B-CLL)患者瘤细胞膜表面独特型单链抗体(Idiotypic determinant single-chain antibody,Id-ScFv)和Hsp70两种蛋白,在体外研究两者联合抗瘤作用并初步探讨其机制。方法:分别在大肠杆菌中表达Id-ScFv和Hsp70两种蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis)及ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)检测鉴定后,分别用金属螯合层析和离子交换层析纯化并在体外将这两种蛋白结合成复合物(Hsp70-Id)。用MTT法及检测Id-ScFv组、人Hsp70组及Hsp70-Id组刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖作用,以ELISA法检测各组培养上清中IL-12和TNF-α水平,并用流式细胞术检测各组PBMC亚群的变化。用活细胞计数法检测各组被激活的PBMC对慢性B细胞白血病细胞株Daudi、慢性髓性白血病细胞株K562和肝癌细胞株HepG2的杀伤作用。结果:经SDS-PAGE电泳分析纯化后表达产物的分子量大约为30ku(Id-ScFv蛋白)和70ku(Hsp70蛋白),分别与其理论预期值相符。PBMC的增殖作用、培养上清中IL-12和TNF-琢水平,Hsp70-Id组明显强于Id-ScFv组和人Hsp70组(P<0.05),而Id-ScFv组和人Hsp70组明显强于阴性对照组(P<0.05)。流式细胞术检测显示在Hsp70-Id组、Id-ScFv组和人Hsp70组PBMC中CD8+T细胞亚群的百分率均有增加,其中Hsp70-Id组最明显。在Id-ScFv组和Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用较K562、HepG2细胞强(P<0.05),且Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用明显强于Id-ScFv组(P<0.001)。结论:成功获取B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70两种纯化蛋白;Hsp70-Id在体外可增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖、活化CD8+T细胞并诱导具有抗肿瘤作用的Th1型细胞因子的分泌有关。 展开更多
关键词 慢性B淋巴细胞性白血病 表面独特型单链抗体 人热休克蛋白70
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小细胞肺癌2F7单抗ScFv的高效表达及复性研究 被引量:2
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作者 马钢 张毅 +2 位作者 胡晶莹 朱明洁 赵新泰 《肿瘤》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期3-6,共4页
目的在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法利用:PCR方法将2F7单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一人工设计的柔性连接肽(Linker)连接,再将单链抗体基因重组到原核表达载体pQ... 目的在大肠杆菌中高效表达小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体(ScFv),并获得具有生物学活性的ScFv。方法利用:PCR方法将2F7单抗重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一人工设计的柔性连接肽(Linker)连接,再将单链抗体基因重组到原核表达载体pQE31中,构建单链抗体高效表达载体pQE-2F7-ScFv。将pQE-2F7-ScFv质粒转化大肠杆菌M15后诱导表达,并对表达产物进行纯化和稀释复性。结果 获得了2F7单链抗体的高效表达,表达蛋白大小约27.4kD,以包涵体形式存在。包涵体蛋白在经过变性、纯化和稀释复性后,获得了有功能的单链抗体。结论 成功地构建和表达了小细胞肺癌单抗2F7的单链抗体,并对其进行了纯化和复性,将进一步促进2F7单抗小分子抗体的应用。 展开更多
关键词 单抗2F7 scfv 复性 小细胞肺癌 基因表达 单克隆抗体 单链抗体 临床诊断 免疫治疗
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