二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的毒性作用

目的探讨二甲苯对妊娠小鼠及胚胎发育的影响。方法对妊娠初期的雌性小鼠采用静式吸入染毒法进行二甲苯染毒,观察胎鼠体重变化;原子吸收分光光度测定法(atomic absorption spectroscopy,AAS)检测妊娠母鼠血清Fe2+、Mg2+含量;单细胞凝胶电泳法(single cell gel electrophoresis,SCGE)检测妊娠母鼠外周血有核细胞DNA损伤程度。结果染毒各组妊娠母鼠血清Fe2+、Mg2+含量下降(P<0.01,P<0.05),并具有统计学意义;染毒组妊娠母鼠外周血有核细胞发生DNA断裂并形成彗尾图像;染毒各组胎鼠体重较正常组相比均显著下降,且存在显著性差异(P<0.05);部分胎鼠表现为胚胎被吸收、脑膜脑膨出、椎骨发育不全等。结论二甲苯可造成妊娠母鼠血清Fe2+、Mg2+含量下降、外周血有核细胞DNA损伤并致使流产发生;二甲苯引起胎鼠体重下降,并影响生长发育。

细胞凋亡率检测方法的探索

目的探索可用于全面准确评价细胞凋亡率的检测技术。方法选取地塞米松诱导胸腺细胞凋亡模型,用流式细胞术及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对处于不同凋亡阶段的胸腺细胞凋亡率进行检测分析。结果流式细胞分析对于早期凋亡胸腺细胞的检测不仅具有高度灵敏性,而且可有效区分凋亡与坏死细胞,但对于凋亡晚期细胞膜严重受损乃至破碎的细胞,单纯流式细胞仪检测不能有效反映真实凋亡率;借助琼脂糖凝胶电泳法可检测破碎后释放到胸腺组织或培养基内的DNA碎片;当凋亡严重导致大量细胞破碎降解时,对样本进行细胞计数比较亦有重要参考价值。结论为全面和准确地评估细胞凋亡率,需选择多种检测方法结合分析,细胞学及寡核苷酸片段检测技术是一个相当不错的选择。

不同上样方式对蛋白质组双向电泳图谱质量的影响比较

蛋白质组技术难点之一是如何获取尽可能多的细胞或组织的蛋白信息.双向电泳蛋白斑点数目直接反映了实验蛋白质组信息的完整性.除样品制备外,蛋白上样方式对双向电泳图谱的质量和完整性有直接的影响.实验论文从以下3个方面考察不同的蛋白上样方式对双向电泳图谱的影响;即:水化上样与杯上样;一次上样与重复上样;以及酸性端加样与碱性端上样.实验结果发现;蛋白上样量较大时,杯上样方式的图谱斑点数目较水化上样方式明显增多;样品蛋白浓度较高时,稀释多次上样明显优于一次性浓缩蛋白上样;蛋白裂解液(MCF-7乳腺癌细胞)在酸性端加样对偏碱性蛋白的分离未发现明显优势.相反,在等电聚焦伏小时(Vh)足够的前提下,碱性端加样对偏碱性端蛋白反而有利,表现为斑点数目较多,而且等电点方向拖尾减轻.实验结果对提高双向电泳的质量以及相关蛋白质组信息的完整性提供了有益的技术参考.

脉冲场凝胶电泳分子分型追溯霍乱传染源研究

目的了解湖南省2005年霍乱疫情分离菌株与常规监测的外环境和水产品中霍乱弧菌分离株之间的遗传相关性,追溯传染源,为预测疫情和制定防治措施提供依据。方法采用PCR检测霍乱菌毒力基因,以脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行菌株的分子分型。结果所有菌株均具有CT基因,20株菌的PFGE为1个型。结论20株霍乱弧菌均是产毒株,具有致病性;湖南省从甲鱼中分离的O139群霍乱弧菌与同期流行的O139群霍乱弧菌分型的带型一致,分子流行病学分析提示甲鱼可能是湖南省近年霍乱疫情主要传染来源之一。

盐渍青菜真菌菌群结构DGGE分析及酵母菌分离鉴定

盐渍青菜又称酸菜,是制作川菜及其调味品的一种非常重要的食品原料,对其菌群结构的研究与功能微生物的分离可以为工业化生产提供理论依据。采用变性梯度凝胶电泳技术(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)对不同盐渍青菜样品的真菌菌群结构进行了分析,结果表明,随着盐渍时间的延长,优势条带数量逐渐增多,真菌以酵母菌为主。4个主要的优势条带分别与假丝酵母属(Candida)、德巴氏酵母属(Debaryomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)的菌株相似。从盐渍青菜样品中分离得到10株酵母菌,通过分子生物学鉴定为汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。PCR-DGGE技术对盐渍青菜菌群结构的解析不依赖培养,方法简便快捷,能够直观准确地分析盐渍青菜的真菌菌群结构。

上海市肠炎沙门菌流行特征和分子分型研究

[目的]分析上海市2006—2007年肠炎沙门菌菌株,了解上海市肠炎沙门菌分子流行病学特征。[方法]回顾2002—2007年肠炎沙门菌食品株来源并与肠炎沙门菌腹泻株作耐药性比较;对2006—2007年全球沙门菌监测(GSS)病例和食品分离的肠炎沙门菌进行表型验证、药敏试验和脉冲凝胶电泳(PFGE)分析。[结果]2006—2007年肠炎沙门菌在本市非伤寒沙门菌病例中列首位,而80%的食品株源自禽及禽肉制品,食品株的抗生素耐药性高于腹泻株。2007年肠炎沙门菌腹泻株的耐药谱和2006年有较大差异。包括13株食品株在内共76株肠炎菌株可分为21种PFGE带型,遗传同源性接近80%,优势带型依次为3型(34株)、1型(12株)、2型(5株)和5型(5株),除2型外均发现有与腹泻株同型的食源株。2006和2007年的PFGE 1/2型病例分别为4例和12例。[结论]上海市肠炎沙门菌病例与食用污染的鸡肉等禽类制品有密切关系,PFGE 3型肠炎沙门菌是目前上海市肠炎沙门菌流行株的优势菌型,2007年发现由鹅肝传播的1/2型肠炎沙门菌可能是3型的变异株并有取代之成为流行菌株的趋势。开展对腹泻病例和食物链的综合监测和以实验室为主的实时分子分型检测能快速预警肠炎沙门菌散在爆发和追溯污染源。

家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1的分子特性分析及其抗真菌作用

制备家蝇Musca domestica幼虫血淋巴中的抗真菌肽,对其分子特性及抗真菌机制进行研究。通过C18柱固相萃取、反相高效液相色谱相结合的方法,成功制备到家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1。SDS-PAGE分析结果表明,MAF-1的分子量为17.136kDa。通过圆二色谱测出水溶液中MAF-1主要以α螺旋及β折叠为主。扫描电镜观察结果显示,MAF-1作用白假丝酵母菌Candida albicans1h后,部分真菌出现表面凸凹不平,细胞结构模糊;随着作用时间的延长,表面形成很明显的凹陷,皱缩,个别菌体破裂,内容物外泄,病变真菌发生率高于对照组。单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)结果显示,正常对照组的真菌呈现典型的圆形,而实验组则出现明显的拖尾现象即形成"彗星"样细胞特征,细胞迁移距离明显高于对照组。SDS-PAGE图谱显示,MAF-1作用后的白假丝酵母菌菌体蛋白谱带一些条带明显变浅,条带数下降,甚至消失。结果提示MAF-1可能具有独特的抗真菌机制。

燕窝鉴别中的蛋白质电泳研究

目的：探讨SDS-PAGE和等电聚焦电泳应用于燕窝蛋白分离及燕窝鉴定中的可行性。方法：提取印尼燕窝、怀集燕窝及常作为伪品的明胶、银耳、猪皮的蛋白质,进行SDS-PAGE和等电聚焦电泳研究。结果：印尼燕窝与怀集燕窝在SDS-PAGE图谱上可见明显差异,而明胶、银耳和猪皮等伪品可见特征性蛋白条带。燕窝蛋白经等电聚焦电泳可见清晰的蛋白条带,且主要集中于酸性端。结论：SDS-PAGE和等电聚焦电泳均可获得燕窝蛋白质的特征性电泳图谱,用于鉴别不同品种燕窝及掺伪燕窝是可行的。

燕麦麸分离蛋白的酶解对其功能性质的影响

为了改善燕麦蛋白的功能性质以扩大其在食品工业中的应用,该文以燕麦麸为原料制备了燕麦麸分离蛋白(OBPI),并利用胰蛋白酶对其进行水解,得到了3种不同水解度(4.1%、6.4%、8.3%)的酶解产物。SDS-PAGE分析结果表明OBPI中的主要蛋白成分是球蛋白,其经过胰蛋白酶处理后,球蛋白酸性亚基被部分水解而碱性亚基相对保持完整。胰蛋白酶水解显著改变了OBPI的功能性质。在所考察的水解度范围内,随着水解度的升高,酶解产物的溶解性、持水性、乳化活性及起泡能力等方面均逐渐增加;但持油性、乳化及泡沫稳定性有不同程度的降低。

同时放化疗敏感性不同宫颈癌组织的二维电泳图谱建立及质谱分析

目的:分析同时放化疗后高敏感和低敏感中晚期宫颈癌组织之间蛋白质组的差异,为确定宫颈癌同时放化疗敏感性相关蛋白提供依据。方法:收集治疗前的中晚期宫颈癌活检组织标本,均为中分化鳞癌,置于—80℃超低温冰箱保存。同时放化疗后,根据WHO实体瘤疗效判断标准,将收集的10例宫颈癌组织标本分为高敏感组(5例)和低敏感组(5例);提取组织总蛋白,进行双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)得到凝胶图谱,采用PD-quest 7.0软件进行匹配和差异分析,识别两组之间表达差异蛋白点。将部分差异蛋白点进行胶内原位酶解后进行MALDI-TOF-MS分析,获取肽质量指纹图,数据库搜索鉴定蛋白质。结果:建立了分辨率高,重复性好的同时放化疗后宫颈癌组织高敏感组和低敏感组的双向凝胶电泳图谱。高敏感组蛋白点数为781±74个,低敏感组蛋白点数为766±52个,组间平均匹配率为87.6%。质谱分析成功鉴定15个差异表达蛋白,其中7个蛋白质在高敏感组高表达,8个蛋白质在高敏感组低表达。结论:蛋白质2-DE图谱和质谱鉴定结果说明同时放化疗后高敏感组和低敏感组宫颈癌组织间存在蛋白质表达的差异,这些蛋白质可能与同时放化疗敏感性有关。

细鳞斜颌鲴不同组织中LDH同工酶的比较研究

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和特异性染色方法分析了细鳞斜颌鲴脑、肾脏、肝脏、肌肉、心脏和眼6种组织的LDH同工酶,结果表明酶谱的表达具有明显的组织特异性。酶带共由三个基因座位(Ldh-a、-b-、c)编码,在6种组织中共检测到7条带,其中脑、肾脏、心脏和眼四种组织中均发现3条带,肝脏中7条带,肌肉中1条带且为超显性,在PAGE胶趋向阴极侧检测到4条肝脏组织所特有的Ldh-c基因编码带;各组织中酶带活性顺序为脑LDH-1>LDH-2>LDH-3,肾脏LDH-3>LDH-1>LDH-2,肝LDH-3>LDH-5>LDH-2>LDH-6>LDH-1>LDH-4>LDH-7,心脏LDH-1>LDH-2>LDH-3,眼LDH-3>LDH-1>LDH-2,肌肉仅有LDH-3;由迁移率R f(LDH-A4)<R f(LDH-B4)判断细鳞斜颌鲴LDH同工酶泳动类型为B>A;对酶谱进行扫描分析及亚基计算得到了一致的结果:脑和心脏两种组织中Ldh-b基因表达占优势而肾脏、肝脏、眼和肌肉中Ldh-a基因表达占优势。

甲醛致Wistar大鼠骨髓细胞遗传毒性研究

目的检测经不同浓度甲醛染毒后所致大鼠骨髓细胞的遗传损伤。方法采用KCl-SDS沉淀法检测液态甲醛所致DNA-蛋白质交联(DPC)效应和单细胞凝胶电泳技术检测甲醛对DNA的损伤效应。结果低浓度的甲醛(5μmol/L和25μmol/L)不能引起DNA-蛋白质的交联但可造成骨髓细胞DNA的严重断裂(P<0.01);较高浓度的甲醛(125μmol/L,625μmol/L)可以产生明显的DNA-蛋白质交联作用(P<0.01)。结论甲醛可造成骨髓细胞DNA的断裂和DNA-蛋白质交联,而DNA-蛋白质交联可以对细胞产生严重的遗传毒性,这可能是甲醛导致白血病的分子机制。

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性。方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种。应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定。应用多重Real-tim ePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因。对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较。ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性。结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性。血清型为O157:H7。毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性。PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%。结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关。STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁。

凝胶电泳-毛细管液相色谱-质谱联用技术分析大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组

通过凝胶电泳将大肠癌患者的手术标本组织(肿瘤与癌旁)中的总蛋白按照分子量分成不同的组分,经胶内水解后,利用毛细管液相色谱-质谱联用技术对各个组分的多肽混合物进行蛋白质组学分析,共鉴定出29种差异表达的蛋白质,其中肿瘤组织中表达上调的蛋白质19种,如Fibrinogen beta chain,Vimentin,Fibrinogen gamma chain,Histone H2A type 1-B/E,Isoform 1 of Periostin,Fibrinogen alpha chain,Histone H3.1,Alphaenolase,Protein disulfide-isomerase A3等;在肿瘤组织中表达下调的有10种蛋白质,如Sarcomeric tropomyosin kappa,Transgelin,Heat shock protein beta-1,Talin-1,Isoform 2 of Vinculin,Isoform 1 of Filamin-C等。通过蛋白质印迹实验对其中的踝蛋白1(Talin-1)和烯醇化酶(Alpha-enolase)的蛋白质组学鉴定结果进行了验证。生物信息学分析表明在大肠癌组织中表达上调的蛋白多具有胞外分泌的属性,提示这些蛋白很有可能会渗透到机体内的循环系统中,从而在患者血液或者腹水中能够被检测到;而在大肠癌组织中表达下调的蛋白则多为细胞骨架、胞外基质纤维等的组成成分,这些蛋白的下调常与肿瘤细胞向周围组织的侵袭和转移有密切关系。本研究为大肠癌的早期诊断、大肠癌初筛等方面的研究等提供了基础数据,对进一步深入研究大肠癌发病机制具有重要意义。

DGGE技术的原理及其在动物胃肠道微生态系统研究中的应用

利用传统的培养方法很难将动物胃肠道的所有菌群进行培养,因此也很难鉴别各个时期动物胃肠道微生物之间的差异。变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术可以避免传统方法的弊端,进而可以进一步确定动物胃肠道微生态系统的差别以及菌群的多样性。主要综述了DGGE技术的原理﹑优缺点以及在动物胃肠道微生态系统研究中的应用和前景。

单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用

单细胞凝胶电泳又称彗星试验,是一种在单细胞水平上检测DNA单、双链断裂和碱性不稳定位点的方法,具有敏感、稳定、快速的优点.近些年来,该方法广泛应用于遗传毒理、环境监测和细胞凋亡等的研究.本文就彗星试验检测DNA损伤方法的原理,评价指标,影响因素以及在一些方面的具体应用进行了综述.

聚丙烯酸分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白的方法及影响因素

以苦瓜籽为材料，研究了聚丙烯酸分离纯化苦瓜种仁碱性蛋白的方法及影响因素。等电点沉淀试验表明，柠檬酸、盐酸分别调节苦瓜种仁粗提液pH至6．0、4．0时，各有14．62％和32．49％的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸的等电点沉淀作用呈现阶段性特点，pH6．0和4．0时分别有26．17％和38．72％的苦瓜种仁蛋白被沉淀。醋酸、盐酸和柠檬酸处理的1mL苦瓜种仁粗提液（pH4．0），1％PAA选择性沉淀碱性蛋白（等电点pI为8，65～9．30）的最佳用量分别为100μL、120μL和100μL。醋酸调节苦瓜种仁粗提液pH分别至5．0、4．0和3．0，等电点沉淀后的上清液用PAA沉淀碱性蛋白，当PAA（1％）用量为160μL/mL提取液时，pH5．0和3．0样液分别有33．77％和43．56％蛋白质被沉淀；当PAA用量为120μL/mL提取液时，pH4．0样液中30.83％蛋白质被沉淀。PAA-蛋白质复合物溶解于碱性溶液（pH〉9．0），当溶液NaCI浓度为3．0％时，溶液蛋白质浓度最高。PAA选择性沉淀的苦瓜种仁碱性蛋白经SephadexG-75柱层析分离，分别在175min和300min出现主峰Ⅰ和Ⅱ。SDS-PAGE和IEF分析表明主峰Ⅰ的分子量约为30kD，pI值约为9.5，主峰Ⅱ的分子量约为10kD,pI值约为9.3。

利用清蛋白PAGE技术鉴定甜玉米杂交种初报

利用改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对7个甜玉米杂交种的清蛋白进行分析。结果表明,甜玉米种子清蛋白存在一定的多态性,每个品种都有各自独特的清蛋白PAGE“指纹”。利用该技术对7个不同甜玉米杂交种的种子纯度进行了室内检验,同时利用田间种植鉴定法进行了测定,通过对其中5个杂交种的电泳纯度和田间纯度进行相关分析,二者达显著水平(r=0.9408),说明改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术用于甜玉米种子纯度鉴定是可行的,可用于甜玉米杂交种纯度鉴定。

头孢克肟诱导肠道菌群紊乱动物模型的建立

目的:构建头孢克肟诱导的小鼠肠道菌群紊乱模型。方法:将40只体重18~22 g的SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为正常对照组、头孢克肟低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组10只。灌胃剂量分别为187.75 mg/(kg·d),375.50 mg/(kg·d),563.25 mg/(kg·d),正常对照组灌胃相同剂量的蒸馏水。连续灌胃7 d后颈椎脱臼处死并收集盲肠内容物,采用传统培养结合聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)观察和分析头孢克肟对小鼠肠道菌群的影响。结果:高剂量组小鼠粪便中乳酸杆菌数量在所选稀释度下降至30CFU以下,而肠球菌数量上升至1.26×105CFU,大肠杆菌数量上升至1.86×106CFU。与空白对照组相比,模型组小鼠肠道菌群总体多样性和细菌种类显著降低。结论:中剂量和高剂量头孢克肟均能不同程度的诱导小鼠肠道菌群紊乱模型,并且肠道菌群紊乱程度随灌胃剂量的增加而加重,模型成功建立。

双向电泳联用质谱技术研究松材线虫和拟松材线虫的差异蛋白

松材线虫是造成松树萎蔫病的病原,对松林威胁很大。其近似种拟松材线虫与松材线虫在形态学上极其相似,却不具致病性。所以,松材线虫和拟松材线虫的快速检测至关重要。应用双向电泳联用质谱技术,研究松材线虫和拟松材线虫的蛋白差异,并对差异蛋白进行MALDI-TOF/MS分析以及数据库鉴定,共鉴定了45个差异蛋白,其中松材线虫22个、拟松材线虫23个。不仅为松材线虫和拟松材线虫的准确鉴定打下基础,差异蛋白的进一步研究可望揭示松材线虫的致病机理。