Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶Leu277突变提高α-环糊精产量

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase,CGTase)能够以淀粉为底物发生环化反应生成环糊精,包括α-环糊精(α-cyclodextrin,α-CD)、β-环糊精及γ-环糊精,其中α-环糊精产量低且易降解。该研究选择Bacillus stearothermophilus NO2来源的CGTase,考察其突变体E142P、L277M、L277F、E142P/L277M、E142P/L277F、L277M/N353A及L277F/N353A以可溶性淀粉为底物生产α-CD的能力。与野生型相比,最优突变体为E142P/L277M,α-环糊精产量提高1.7 g/L,且在产物中占比提高14.3%。分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟结果表明,E142P/L277M突变体中2个突变位点相互影响较小。此外,L277M/N353A催化效果较差,MD结果表明该突变体整体结构变化较大且溶剂可及表面积增大,不利于转糖苷反应的发生。该研究为CGTase的分子改造提高环化反应活性以及CGTase在α-环糊精工业化生产中提升产量提供了新思路。

人乳头瘤病毒18型L1-E6、L1-E7嵌合基因表达载体的构建及表达

目的 构建HPV 18L1 E6、L1 E7嵌合基因的表达载体 ,并在CHO细胞中表达。方法 克隆HPV 18L1 E6和L1 E7基因 ,插入中介载体 pGEMT Easy中并测序鉴定。采用PCR定点突变法 ,突变L1 E6、L1 E7基因序列中与转化作用相关的位点 ,分别与L1基因连接后插入真核表达载体 pVAX1,构建真核表达质粒 pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx。用磷酸钙沉淀法 ,转染CHO细胞 ,以抗HPV 18L1、抗E6和抗E7特异性单克隆抗体 (mAb)做ELISA和免疫细胞化学法检测。结果 ELISA检测显示 ,转染各种pVAX1 L1E6Mxx、 L1E7Mxx融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫细胞化学检测 ,在胞浆、胞核可见棕黄色颗粒。结论 所构建的 pVAX1 L1E6Mxx E7Mxx融合蛋白表达质粒 ,可在转染细胞内表达相应的L1 E6Mxx和L1 E7Mxx蛋白 ,为今后进行DNA疫苗的研究奠定了基础。

定向引入N⁃糖基化位点促进芳基醇氧化酶热稳定性及底物亲和力

芳基醇氧化酶在木质素降解过程中发挥重要作用,N-糖基化修饰影响其酶学性质。该文旨在通过研究刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)来源的芳基醇氧化酶N-糖基化,来提高其热稳定性和底物亲和力。利用毕赤酵母GS115表达系统和定点突变技术,构建表达6种芳基醇氧化酶突变体蛋白,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和热稳定性分析。结果表明,芳基醇氧化酶N89和N249糖基化位点突变导致最适温度和70℃时酶热稳定性降低;在这个过程中,将其引入新的糖基化位点后的突变体,其最适酸碱度没有变化,最适温度以及70℃下的热稳定程度都明显优于野生型;以藜芦醇为底物时,突变体[AAO(F-X-N-X-T)]与底物亲和力最高。N-糖基化主要影响芳醇氧化酶的热稳定性,其中N89和N249位点的N-糖基化对酶的热稳定性起重要作用;引入N-糖基化位点[AAO(F-X-N-X-T)]能获得具有高活力和高稳定性的芳醇氧化酶。

天花粉蛋白突变体TCS_(KR173-174CG)的构建、表达与纯化

目的构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模板,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Ni-NTA层析纯化。结果目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论已成功构建了TCS突变体基因,并获得高效表达。

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。

用于降解邻苯二甲酸酯的红球菌来源酰胺酶RhoⅡ突变改造

邻苯二甲酸酯(phthalate esters,PAEs)具有生理毒性,去除毒性的关键在于侧链酯键的完全水解。红球菌源酰胺酶RhoⅡ是作用于邻苯二甲酸单酯酯键的水解酶,但不能水解PAEs。采用计算机模拟和定点突变的方法,对RhoⅡ进行改造,以实现水解PAEs的目的。将RhoⅡ与邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)进行分子对接,结果显示,RhoⅡ以Lys200、Arg185的R基稳定MBP的羧基,MBP与RhoⅡ的两个单体均形成氢键相互作用。位点突变表明,Asp39、Lys127和Cys160构成了RhoⅡ的催化三联体,作为活性中心存在于酶的疏水凹槽内。此外,通过定点突变获得了具有水解PAEs的突变酶F44N,与原酶相比,其水解邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)的能力显著提升,这是由于苯丙氨酸突变为天门冬酰胺后,明显削弱了酶对底物的空间位阻作用,使酶的底物结合空腔体积增大,DBP、DIBP能够与酶进行结合,实现酯键水解。结合突变前后对接结果推测,突变影响酶的底物结合空腔,导致突变酶不能有效催化邻苯二甲酸单酯。通过验证RhoⅡ的催化活性中心,突变关键位点,实现了RhoⅡ底物谱的改变,希望可以丰富催化水解PAEs的酶资源,促进相关水解酶更好的应用。

白念珠菌14-α脱甲基酶K143Q氨基酸置换与氟康唑耐药形成的相关性研究

目的研究临床耐氟康唑白念珠菌14-α脱甲基酶的K143Q氨基酸置换与氟康唑耐药形成的关系。方法运用体外定点突变技术构建ERG11基因A427C突变型重组质粒,并利用酶切、连接构建YES2/CT酵母表达质粒。通过构建成的表达质粒在酿酒酵母中的异源性表达及体外药物敏感性表型的检测,分析其致K143Q氨基酸置换与白念珠菌对氟康唑产生耐药的关系。结果真菌体外药物敏感性表型检测显示,含氨基酸置换的表达质粒转染于酿酒酵母INVSc1后,氟康唑最低抑菌浓度(MIC)增加16倍。结论 K143Q可增强白念珠菌对氟康唑的耐药性。

乳腺癌核仁磷蛋白乙酰化及其修饰位点突变体的构建和表达

目的明确女性乳腺癌中核仁磷蛋白(NPM)乙酰化修饰水平,并通过修饰位点突变体的构建探讨其功能。方法蛋白质修饰组学方法检测对比人乳腺癌组织及癌旁正常组织(各3例)NPM乙酰化水平及乙酰化位点;基因定点突变PCR构建NPM乙酰化突变体,限制性内切酶(DpnI)消化及大肠埃希菌转化获得特异性突变体重组质粒;双酶切与测序验证各突变体序列准确性;瞬时转染及RT-PCR方法检测各突变体过表达效果。Western blotting验证NPM乙酰化水平,蛋白质定量组学及生物信息学分析NPM乙酰化功能。结果乳腺癌组织样本中NPM第27及第32位赖氨酸乙酰化水平分别为癌旁正常组织的2.76及2.22倍;构建的NPM乙酰化位点突变体与野生型NPM分子量一致且出现预期突变位点;转染NPM各突变体的BT-549细胞相应NPM mRNA表达水平明显升高。随着野生型NPM表达水平增加,蛋白乙酰化水平增加,27位赖氨酸发生负向突变后,修饰水平下降。NPM乙酰化可使BT-549细胞中101种蛋白表达水平发生明显变化,上述蛋白在细胞大分子生物合成,以DNA为模板的转录过程,RNA生物合成以及RNA代谢过程中富集。结论乳腺癌NPM呈高乙酰化水平并可能在细胞大分子生物合成,转录过程,RNA生物合成以及RNA代谢过程中发挥关键功能。

枯草芽孢杆菌YvdSR蛋白转运Na^(+)关键残基的研究

对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis strain 168)双组分基因YvdSR表达的双组分蛋白YvdSR进行功能鉴定,得出YvdSR具有转运Na^(+)/Li^(+)功能,为探究YvdSR离子转运机制,分别对两种组分作同源序列比对,从每种组分中筛选出完全保守的酸性氨基酸残基并进行氨基酸残基定点突变。结果表明,YvdS和YvdR共有的E13在同源物中完全保守且突变为丙氨酸后均失去Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运活性,说明两种组分的E13均是蛋白质行使功能不可或缺的,YvdS的E13A经回复突变后可恢复高水平Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运活性,YvdR的E13A经回复突变后仍失去Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运活性,表明YvdS和YvdR在Na^(+)(Li^(+))/H^(+)逆向转运中行使不同功能。

α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化

3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn^(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co^(2+)、Fe^(3+)、Fe^(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。

猪细小病毒SC-1株VP2基因的定点突变及其对该基因表达的影响

根据GenBank中的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列设计并合成了2对突变引物,对PPV SC-1株VP2基因进行了定点突变。利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建含报告基因EGFP的重组质粒pPI-2.EGFP.VP2(A)、pPI2.EGFP.VP2(B);利用脂质体介导法将上述重组质粒转染COS-7细胞,从而研究该突变对VP2基因表达的影响。结果显示,成功构建了含突变体及EGFP的真核表达载体;在倒置荧光显微镜下,突变后的质粒转染呈现不同的荧光信号,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品与阳性对照相似,荧光信号均匀分布于细胞中。提示,突变的引入是导致表达差异的主要原因。

跨膜型TNF-α细胞毒作用与其功能域的关系

目的 :探讨跨膜型TNF α(TM TNFα)的细胞毒作用及其功能域的关系。方法 :采用重组PCR对TM TNFα基因进行定点突变 ,在微粒体膜的存在下体外转录、翻译突变体 ,并观察这些突变体的胞毒作用。结果 :通过重组PCR分别获得TM TNFα第 - 71、31、35、87、95、14 3与 14 7位氨基酸置换的突变体 ,这 7种突变体对L92 9细胞系的细胞毒作用 ,与野生型TM TNFα相比 :第 - 71、14 3位氨基酸单个置换使TM TNFα胞毒作用下降 4倍以上 ,35、95、14 7位单个置换使TM TNFα胞毒作用下降1 5～ 2 5倍 ;而第 31、87与 133位氨基酸突变则对TM TNFα杀伤作用无影响。结论 :除 - 71位氨基酸外 ,以上 6个位点的氨基酸均参与分泌型TNF α(S TNFα)的胞毒功能 ,提示TM TNFα和S TNFα发挥细胞毒功能的功能域可能不完全相同。

人白介素-29变异体在毕赤酵母中的表达及抗肿瘤活性

基于生物信息学分析的结果,采用基因突变和大引物PCR技术完成人白细胞介素-29(h IL-29)成熟肽第33位氨基酸的定点突变,成功实现其在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中的异源表达。重组人白细胞介素-29变异体蛋白(rh IL-29mut33)在不同质量浓度时,对肝癌细胞BEL7402、结肠癌细胞HCT8和胃癌细胞SGC7901的增殖均有抑制作用,而且抑制增殖效应强于野生型rh IL-29。与低质量浓度相比,高质量浓度下rh IL-29mut33对肿瘤细胞增殖抑制作用更强,对上述3种肿瘤细胞的增殖抑制率分别达到(31.76±2.87)%、(22.47±0.26)%和(34.41±0.40)%。rh IL-29mut33良好的生物学活性表明该变异体具有较大的应用潜力。

VP2蛋白Cys-402、Cys-214对猪细小病毒VLPs影响的初步研究

试验以猪细小病毒VP2 Cys-402（A）、Cys-214（B）定点突变体为基础，将突变体真核表达载体转染COS-7细胞及核酸免疫猪细小病毒抗体阴性的小白鼠，通过电镜技术和流式细胞仪技术探讨突变Cys-402、Cys-214对猪细小病毒病毒样颗粒的影响，旨在寻找利于外源基因插入的病毒样颗粒内部位点。电镜和小白鼠核酸免疫试验结果表明：Cys-214对病毒样颗粒的组装和免疫原性的发挥是必需的，其突变后不能促使VP2形成病毒样颗粒，更不能在免疫后的小白鼠血清中监测出相应抗体的存在；而Cys-402的突变并不干扰病毒样颗粒的形成和免疫原性的发挥。由此可以推测Cys-402及其附近可能存在利于外源基因插入的位点。

R262K点突变将紫穗槐二烯合酶变为(3R)-(E)-nerolidol合酶

倍半萜合酶家族催化单一底物法尼基焦磷酸形成近300多种链式、单环、双环和三环倍半萜烯、醇,进一步的加工修饰产生种类更加繁多的倍半萜衍生物。详细了解倍半萜合酶产物特异性性决定机制将会为倍半萜合酶的理性设计,定向生成新型化合物打下基础。本研究利用定点突变技术,对紫穗槐二烯合酶RxR基序及相关的D300位点进行了点突变,发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(3R)-(E)-nerolidol,而R262L突变使酶失去活性,R264K突变则对产物比例无影响,显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要,结合R262突变结果,推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。由于RxR基序在倍半萜合酶家族中非常保守,因此其作用是否具有普遍性值得进一步验证。

C-端设计定点突变提高 Streptomyces Avermitilis壳聚糖酶稳定性及催化活性

为提高阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)SaCsn46A壳聚糖酶的温度稳定性,利用SWISS-MODEL在线服务器,以链霉菌SirexAA-E壳聚糖酶(PDB登录号:4ily.1A)为模板对SaCsn46A的蛋白结构进行同源模拟,将预测获得的SaCsn46A蛋白结构提交至在线预测软件PoPMuSiC-2.1,寻找对SaCsn46A稳定性有显著影响的氨基酸残基,通过定点突变构建突变体,在大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta中异源表达野生型壳聚糖酶及突变体。经Ni-NTA亲和层析获得电泳纯重组酶蛋白,测定野生型壳聚糖酶及突变体G237A的酶学性质,发现突变体最适温度提高5℃,并且温度稳定性及pH稳定性显著提升。为进一步提高突变体的表达效率,对突变体表达菌株进行诱导条件优化,确定最优条件为IPTG浓度0.7 mmol/L,诱导温度20℃,诱导时间8 h。

SEA组件174-201位氨基酸对大鼠黏蛋白rMuc3羧基端酶切的影响

目的探讨大鼠黏蛋白3(rMuc3)羧基端SEA组件内174-201位氨基酸对LSKGSIVV基序酶切的影响。方法采用ClustalX1.83软件对包含SEA组件的蛋白质进行比对,选择SEA组件后续79个氨基酸中保守的氨基酸残基,利用定点突变技术将这些保守残基突变为终止密码子,分别命名为p20t1、p20t2、p20t3、p20t4,并测序验证。将不同长度的突变体转染COS-7细胞,用N-端V5标签抗体行Western blotting,检测各突变体的酶切情况。结果rMuc3羧基端第174位丝氨酸(S)、第201位半胱氨酸(C)、第212位酪氨酸(Y)、第223位酪氨酸(Y)在多种含SEA组件的蛋白质中非常保守。Western blotting检测结果表明,含rMuc3羧基端的p20及突变体p20t2、p20t3、p20t4的表达产物在LSKGSIVV基序处均能发生酶切,均可检测到30kD的酶切后片段,但p20t1的表达产物在LSKGSIVV位点处不能发生蛋白酶切。结论rMuc3羧基端第174位S至第201位C残基对LSKGSIVV基序酶切的发生至关重要,是SEA组件在LSKGSIVV基序发生蛋白酶切的另一必要条件。

一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM(proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V,1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q,1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%~70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%~70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。

PPVSC-1株VP2基因的定点突变及真核表达载体的构建

以PPV VP2为基础,利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并将突变体克隆入pMD19-T Simple载体中;经酶切、PCR和测序鉴定后,利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点,定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建突变体与报告基因EGFP融合表达的pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)真核表达载体;利用脂质体法将重组质粒分别转染COS-7细胞。结果:成功构建了突变体的真核表达载体;在转染后的荧光观察中发现,pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)质粒转染细胞后,两者表达后的荧光信号不同,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品的荧光信号均匀分布于细胞中。提示,突变是引起表达差异的主要原因。

利用体外定点诱变技术构建人突变型α-L-艾杜糖醛酸酶基因

【目的】构建突变型α L 艾杜糖醛酸酶基因 (IDUA)cDNA ,为体外表达、鉴定突变的性质提供物质基础。【方法】以野生型pcDNA3 IDUA为基础质粒 ,采用双引物法体外定点诱变技术 ,引入突变E40 4X。【结果】突变区域经PCR SSCP和测序证实诱导突变成功。【结论】本研究成功构建了突变型IDUAcDNA ,可用于下游的体外表达 ;此定点突变技术具有简便、诱变效率高等优点 ,是体外构建突变型基因的一种有效方法。