DT40细胞sIgMλ轻链基因的克隆鉴定及原核表达

本研究利用RT-PCR技术,从鸡法氏囊淋巴瘤细胞系DT40中扩增sIgMλ轻链基因并在E.coli中进行了表达。序列分析结果表明,sIgMλ轻链基因全长852nt,含有一个长度为657nt的ORF及长度为195nt的3'-UTR,该基因与鸡Igλ基因的序列同源性为95%,差异位点主要存在于λ轻链的可变区。氨基酸序列预测结果表明,DT40sIgMλ蛋白与鸡Igλ蛋白的序列同源性为92.6%。构建的原核表达载体pET-λ在E.coliBL21(DE3)中成功的获得大量表达。本实验为进一步研究sIgM在IBDV感染法氏囊B淋巴细胞中的作用奠定了基础。

DT40细胞sIgMλ轻链基因敲除载体的构建

从鸡B淋巴DT40细胞系中克隆-βactin启动子,替换pCDNA3.1(+)载体中的SV40启动子,构建-βactin启动子驱动的Neomycin抗性基因表达框。将克隆的sIgMλ轻链基因两侧各约2 kb的序列插入到抗性表达框的两侧作为同源臂。PCR、酶切以及测序结果表明成功构建了靶向sIgMλ轻链基因的置换型打靶载体pCDNA-act-neo-HR。为建立sIgMλ轻链基因敲除的DT40细胞模型,探究sIgMλ轻链在IBDV感染DT40细胞过程中的作用奠定了基础。