农杆菌介导GNA基因转化菜薹

以菜薹带柄子叶为外植体 ,采用农杆菌介导法将特异启动子PRSs-1与雪花莲凝集素 (GNA)基因构建的嵌合基因转化菜薹 ,获得 2 6株Km抗性植株 ,经过PCR检测和PCR

大肠杆菌中重组GNA蛋白的分离纯化

具有特异结合甘露糖基的雪花莲外源凝集素 (Galanthusnivalisagglutinin,GNA)具有多种生物活性 ,在糖蛋白分离、逆转录病毒病和害虫防治等方面有广泛的应用价值。该试验分别采用超声破碎法、冻融裂解法和溶菌酶法破碎重组大肠杆菌细胞后 ,经尿素或SKL(十二烷基肌氨酸钠水溶液 )溶解后 ,再透析复性获得了在大肠杆菌 (E .coli)中高效表达的重组GNA蛋白 ,并经SDS -PAGE电泳检测GNA的大小、浓度及表达量。通过对诱导表达时间、超声处理的功率、时间、模式、尿素和SKL洗涤浓度 ,透析条件的优化组合 ,建立了一套从大肠杆菌细胞中分离重组GNA蛋白的有效方法 ,为进一步的重组GNA生物活性试验提供了物质基础。

GNA成熟蛋白基因亚克隆及其原核表达载体构建

雪花莲外源凝集素 (GNA)对刺吸式昆虫和某些咀嚼式昆虫以及多种线虫均有毒性。从含GNA前体蛋白基因的质粒中亚克隆出GNA的成熟蛋白基因MGNA ,将MGNA基因插入大肠杆菌表达载体pET2 2b的不同位点 ,再经测序验证 ,得到了三种不同表达形式的GNA原核表达载体 :2 2bG1 (分泌型融合GNA蛋白 )、2 2bG2 (包涵体型GNA蛋白 )、2 2bG3(分泌型天然GNA蛋白 ) ,这为进一步在大肠杆菌中表达GNA和将GNA制成生物农药奠定了基础。

重组雪花莲外源凝集素(GNA)表达条件的优化

研究了含有GNA基因的重组大肠杆菌菌株G2和G3在不同诱导培养温度、起始诱导菌体密度(OD600值)、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度及诱导培养时间等重要因子对重组GNA表达的影响,以期获得重组GNA表达的最佳条件.实验结果表明,不含信号肽的G2菌株和含有信号肽的G3菌株的最佳培养条件分别为:起始诱导菌体密度为OD600≈0.6;诱导剂IPTG浓度为0.1mmol/L;诱导培养时间为6 h;G2和G3的诱导培养温度分别为37℃,28～30℃.该研究结果将为发酵生产重组GNA的工艺提供依据,也为重组GNA开发成为生物农药、试剂和免疫增强剂提供支持.

转雪花莲外源凝集素基因烟草对桃蚜的抑制作用

将编码雪花莲外源凝集素成熟蛋白的ｃＤＮＡＧＮＡ１２和其前体蛋白ｃＤＮＡＧＮＡ３４插入到二元载体ｐＢｉｎ４３８的双倍增强子ＣａＭＶ３５Ｓ启动子或二元载体ｐＢｃｏｐ１的ＣｏＹＭＶ启动子下游，分别构建成植物表达载体ｐＢＧｎａ１２、ｐＢＧｎａ３４、ｐＢＣＧｎａ１２和ｐＢＣＧｎａ３４。土壤农杆菌介导的转化再生植株的ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，ＧＮＡ基因已整合到烟草ＤＮＡ中。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现ｐＢＧｎａ３４和ｐＢＣＧｎａ３４的转基因植株能有效地表达外源ＧＮＡ，表达量约占可溶性总蛋白的００８％～０１５％，并且前体蛋白基因编码的蛋白在植物体内进行了正确的加工；而ｐＢＧｎａ１２和ｐＢＣＧｎａ１２的植株几乎检测不到外源ＧＮＡ的表达。有效表达外源ＧＮＡ的ｐＢＧｎａ３４和ｐＢＣＧｎａ３４的转基因植株具有较强的抗蚜活性，平均能够抑制桃蚜（Ｍｙｚｕｓｐｅｒｓｉｃａｅ）４５％～６０％蚜口密度，有的高达９０％以上。在转基因烟草中含双倍增强子的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子与韧皮部特异表达的ＣｏＹＭＶ启动子介导ＧＮＡ基因表达具有相似的强度，但它们的抗蚜活性存在差异。

雪花莲外源凝集素基因转化番茄

将含有雪花莲外源凝集素基因 (GNA)的质粒pRSSGNA1通过冻融法转化到根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens (SmithetTownsend)Conn)菌株LBA44 0 4中。采用叶盘法转化番茄 (LycopersiconesculentumMill.)栽培品种“C8”、“A3 9”和“A53 ” ,获得了含GNA基因的 43株转化植株。通过卡那霉素抗性鉴定、NPTⅡ基因PCR和GNA基因Southernblot分析表明 ,GNA基因已整合到番茄的基因组中。初步抗蚜虫 (MyzuspersicaeSulzer)试验证明 ,转基因番茄有一定的抗蚜虫效果。 3株转基因植株的NPTⅡ基因在自交子代中的分离比例符合 3∶1孟德尔遗传规律。

根癌农杆菌介导北海道黄杨遗传转化体系的建立

在建立北海道黄杨(Euonymus japonicus ‘CuZhi’)再生体系的基础上,建立其遗传转化体系,以获得转雪花莲外源凝集素(Galanthus nivalis agglutinin,GNA)基因植株。采用根癌农杆菌(Agr-robacterium tumefaciens,LBA4404菌株)介导法,研究影响北海道黄杨遗传转化的若干因素。结果表明,预培养与否、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等对转化频率都有一定的影响。在遗传转化过程中,不经预培养,根癌农杆菌浓度OD600=0.6,侵染下胚轴40min,再共培养3d,有利于获得最高遗传转化效率。抗性植株经PCR和DNA-Southern blot检测表明,目的基因已整合到北海道黄杨基因组中。

高效的水稻基因枪转化和可育转基因植株再生

从水稻品种台北309成熟胚诱导生长3～4周的愈伤组织,经过1～3次继代培养后,可以形成大量颗粒状胚性愈伤组织,适用于基因枪转化实验.将分别含有雪花莲凝集素(GNA)基因、hpt基因的质粒pIP860和p35H混合包裹在金粉上轰击转化上述胚性愈伤组织,在含30～50mg/L潮霉素的培养基上进行筛选、预再生、再生及长根培养.使用干燥处理来增加再生频率和出苗数,并摸索出移栽再生小植株的有效方法.从接种到获得转化小植株只需要13～21周.三次转化实验共轰击536块胚性愈伤组织,获得199个系的2783株潮霉素抗性植株.DNA点杂交检测表明73.4%的抗性植株同时含有GNA基因和hpt基因,Southern杂交分析进一步证实了GNA基因在转基因水稻基因组中的整合.89.3%的转基因植株可育.分子证据表明GNA基因和hpt基因已遗传至子代,并且主要按孟德尔规律进行分离.

基因枪导入法培育抗虫水稻

以含潮霉素抗性基因、GUS基因和雪花莲凝集素 (GNA)基因的 pWRG15 15和pRSSGNA1为供体DNA ,利用基因枪法转化上农香糯成熟胚诱导的愈伤组织。经抗性培养基筛选 ,从轰击的 135块愈伤组织中得 5株转基因植株。GUS检测和PCR分析表明 。

植物表达载体pKC-3的构建及大分子DNA连接策略

以根癌农杆菌双元载体pCAMBIA130 0为基础 ,先后连接含有马铃薯蛋白酶抑制剂 -Ⅱ基因 (PⅡ )、苏云金杆菌毒蛋白基因 (B .tcryI(A) )及雪花莲外源凝集素基因 (GNA)的完整表达片段 ,构建了抗多种稻田害虫的表达载体pKC - 3,将其导入根癌农杆菌LBA4 4 0 4 ,可进一步用于水稻抗虫基因转化的研究。载体构建过程采用多次的大分子DNA片段连接 ,总结出了一套适合大片段连接转化的可行策略。