猪丹毒杆菌SpaA优势表位的串联表达及其免疫效果分析

构建串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗,对其免疫原性进行研究。将猪丹毒杆菌表面保护抗原A优势表位串联表达,提取并经亲和层析纯化获得重组蛋白,制备亚单位疫苗,分别免疫小鼠和猪,21日后攻毒。成功制备串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗,2μg重组蛋白可为小鼠抵抗1000MLD强毒攻击提供100%保护,100μg重组蛋白可为猪抵抗1MLD强毒攻击提供100%保护,可为猪抵抗2MLD强毒攻击提供67%保护。串联SpaA优势表位的猪丹毒亚单位疫苗具有良好的免疫原性。

猪丹毒杆菌SpaA单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定

旨在制备猪丹毒杆菌单克隆抗体,并确定其识别的抗原表位。采用原核表达、细胞融合试验、间接ELISA、亚克隆技术、Western blot、抗原表位以及抗体分型鉴定来研究猪丹毒杆菌表面保护性抗原A(SpaA)的单克隆抗体。结果:制备了SpaA重组蛋白,得到4株稳定分泌的单抗,且这4株单抗均能与SpaA蛋白发生特异性反应,其中1E8、5B3杂交瘤细胞培养上清液抗体效价为1∶1600,5B5、9B5杂交瘤细胞培养上清液抗体效价为1∶3200;1E8重链为IgG 2b,5B3、9B5重链为IgG 1,5B5重链为IgG 2a,轻链均为Kappa;1E8、5B5识别的抗原表位因SpaA蛋白C端的重复序列无法确认,5B3识别的抗原表位为258~267 aa,9B5识别的抗原表位为462~472 aa。综上,本研究制备的单克隆抗体将为猪丹毒杆菌ELISA检测方法的建立奠定基础。

猪丹毒丝菌C43311株spaA基因N端免疫保护区的克隆和表达

采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp,与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较,核苷酸序列同源性在93%～99%之间。SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa,与预期的大小相近。Western印迹检测结果表明,表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应,证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性。

猪丹毒杆菌SpaA基因的生物信息学分析

旨在对猪丹毒杆菌的SpaA基因进行PCR检测,并对该基因所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。首先对猪丹毒杆菌SpaA基因进行PCR检测,后将SpaA基因的保守区域进行生物信息学分析。结果表明,PCR扩增得到了与猪丹毒杆菌SpaA基因大小一致的1 531bp片段,二级结构的预测结果显示,该蛋白主要以螺旋、无规则卷曲为主,只有少数的伸展链。推测该蛋白有4个B细胞抗原表位区域。该研究为猪场猪丹毒杆菌病的检测提供了试验数据,也为阐明猪丹毒杆菌病的免疫机理和制备表位疫苗等奠定理论基础。

丹毒丝菌spaA基因免疫保护区的克隆与功能研究

本研究以丹毒丝菌XJ1249基因组DNA为模板,根据GenBank已发表的丹毒丝菌表面保护性抗原A (SpaA)的序列设计引物进行PCR扩增,得到大小约1 029 bp的spaA基因N端免疫保护片段(spaA-N)。将spaA-N连接到载体pGEX-4T-1上构建重组原核表达质粒pGEX-spaA-N,对重组质粒进行序列验证后,在IPTG的诱导下,表达和纯化重组蛋白r-SpaA-N,并研究其对小鼠的免疫保护作用。结果显示:分离纯化的重组蛋白具有免疫原性,并对小鼠具有免疫保护性,能够有效防止丹毒丝菌对小鼠的侵染。研究结果为进一步研究丹毒丝菌致病机理,开发新的猪丹毒诊断试剂盒和亚单位疫苗奠定了基础。

人乳头瘤病毒L1基因与丹毒丝菌SpaA-N优势抗原表位序列的嵌合重组质粒构建及活性鉴定

为确定丹毒丝菌表面保护性抗原A的N-末端(SpaA-N)优势抗原表位,研发新型表位DNA嵌合疫苗,利用生物信息学软件对丹毒丝菌SpaA-N的优势B细胞抗原表位进行预测,以重叠PCR将优势表位插入人乳头瘤病毒16型的主要衣壳蛋白(HPV-16 L1)HI环结构的编码序列中,构建获得重组嵌合质粒pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA。该重组质粒经体内、外瞬时转染后,RT-PCR均扩增获得了1 500 bp左右的目的片段。免疫印迹试验显示,体外转染嵌合质粒的细胞总蛋白能够与GST-SpaA-N重组蛋白免疫血清在56 kD处产生特异性结合。ELISA分析显示嵌合质粒可在小鼠体内产生差异显著的特异性抗体(P<0.01),抗体滴度为1∶1 000。此外,pcDNA3-HPV-L1-ΔspaA制备的抗血清至少可在1∶10稀释度条件下,介导外源补体对半数以上的菌体进行杀伤。该研究表明,获得的SpaA-N表位DNA嵌合疫苗具有免疫活性,为研发安全有效的丹毒丝菌新型DNA疫苗提供了一个新思路。

一株猪丹毒丝菌的全基因组测序及SpaA基因分析

本研究测定猪丹毒丝菌临床毒株SG7的全基因组序列,并运用生物信息学方法对测定的全基因组序列及猪丹毒丝菌表面保护性抗原A基因(SpaA)进行分析。SG7菌株的基因组全长为1834291.00 bp,G+C含量为36.3%,基因总数1846个。将SG7菌株与GenBank中8条完整的猪丹毒丝菌全基因组序列进行比较,发现国内外不同菌株间基因组的基本信息存在不同程度差异。基于全基因组单核苷酸多态性(SNPs)的系统发育分析结果表明,9株菌株聚为3个分支,国内菌株并不完全处于同一分支,SG7菌株与国内常见菌株不属于同一进化分支。SpaA基因高变区的分析结果显示,9株菌株亦可分为3个SpaA型,SG7菌株为携带Met203的高致病性菌株。除SG7菌株外,其他8株菌株的SpaA基因分型结果与基于全基因组SNPs分析的结果一致,说明SG7菌株的遗传背景复杂。本研究结果可为猪丹毒丝菌基因组整体水平研究和疫苗的研发奠定基础。

猪丹毒丝菌SpaA基因原核表达及表达蛋白质的免疫原性分析

旨在克隆表达猪丹毒丝菌SpaA蛋白,分析其免疫原性,为猪丹毒新型疫苗的研发奠定基础。运用PCR扩增SpaA基因,连接至pGEX-6P-1载体,将阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE分析表达产物,GST亲和层析纯化融合蛋白质,Western blot鉴定;纯化SpaA蛋白免疫小鼠,间接ELISA检测血清中IgG和Th1、Th2相关细胞因子;不同致病力猪丹毒丝菌攻击免疫小鼠,观察病理组织变化及其免疫保护率。结果显示,猪丹毒丝菌SpaA基因在大肠杆菌中实现表达,获得大小为75ku的纯化目的蛋白质。该蛋白质能特异性识别猪丹毒丝菌抗血清,可诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使TNF-β、IFN-γ、IL-5、IL-10含量显著升高,对攻毒菌的免疫保护率均为100%,病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。可见成功获得的重组SpaA蛋白具有良好的免疫原性,能激发机体的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为研发猪丹毒亚单位疫苗的候选抗原。

红斑丹毒丝菌SpaA蛋白保护区域的免疫学检测

为了确定菌体表面保护性抗原A(SpaA)的免疫保护区域,通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中分别扩增出编码成熟SpaA及其N端342个氨基酸序列(SpaA-N)和C端160个氨基酸序列(SpaAC)的基因片段,将它们分别克隆到表达载体pET32a上,转化入大肠埃希菌BL21,IPTG诱导,亲和层析法纯化重组蛋白,并检测它们对小鼠的保护作用。SDS-PAGE结果显示重组SpaA、SpaA-N和SpaA-C以可溶性形式表达在大肠埃希菌BL21细胞质中并具有良好的免疫原性。保护试验结果表明重组SpaA、SpaA-N和NaOH提取抗原完全保护小鼠受强毒株C43065的致死性感染,但重组SpaA-C没有保护作用。结果表明SpaA-N可以作为预防猪丹毒的亚单位疫苗。

转移因子对猪丹毒杆菌SpaA抗原免疫效果的影响

为了探寻转移因子(Transfer factor,TF)对猪丹毒杆菌SpaA(Surface protective antigen A)蛋白抗原免疫效果的影响,将重组SpaA蛋白与双相佐剂乳化后(称SpaA抗原)免疫小鼠,取免疫小鼠和未免疫小鼠脾脏,以超滤法分别制备特异性TF和普通TF,并利用BCA法测定所得TF的质量分数,经过无菌及安全性检测后,将2种TF分别腹腔接种至小鼠体内,24 h后,对2组TF处理后的小鼠均免疫SpaA抗原,并以未接种TF的免疫小鼠作为对照(仅免疫组)。分别于免疫后12 d、21 d和30 d对小鼠进行采血,用间接ELISA法对小鼠血清进行抗体检测。结果表明,利用原核表达系统表达的重组SpaA蛋白分子质量60 ku且具有可溶性;以超滤法制备的特异性TF质量浓度为2.56 mg/mL,普通TF质量浓度为2.40 mg/mL,且2种TF安全无毒;抗体检测数据显示,2种TF处理组在免疫后21、30 d的抗体水平均高于仅免疫组,且差异显著,而2种TF处理组之间抗体水平差异不显著。因此,TF能诱导SpaA抗原快速产生抗体,提高SpaA抗原的免疫效果,但与TF的特异性关系不大,表明TF可作为猪丹毒杆菌基因工程亚单位疫苗的免疫增效剂,提高免疫动物的抗体水平。

猪丹毒丝菌强毒株与弱毒疫苗株SpaA基因生物信息学分析

对猪丹毒丝菌SpaA蛋白进行生物信息学分析,并对比了猪丹毒丝菌弱毒菌株和野生强毒菌株间的差异。结果显示,由于猪丹毒丝菌GC42的SpaA蛋白缺少一段含有80个氨基酸的序列,使得该菌株的蛋白质相对分子质量、氨基酸组成、二级和三级结构与强毒株的SpaA蛋白质相比均有所差异,导致这2株菌株引发机体产生的免疫原性和抗原性强弱有所不同,推测这2株菌株中,SG7菌株的免疫原性相对GC42较强;GC42菌株的抗原性相对SG7菌株的抗原性来说较弱,而猪丹毒丝菌GC42菌株的毒力相对猪丹毒丝菌SG7菌株较弱,因此呈现弱毒菌株特性;推测2株菌株的氨基酸序列均在193~206、217~231、290~309、313~327、328~376、386~457区段具有较高的形成B细胞表位的可能性。

一株猪丹毒杆菌的分离鉴定及spaA基因序列分析

从猪丹毒疑似病例肺脏中分离到1株革兰阳性小杆菌,编号为YN19071,对其进行形态学、分子生物学鉴定,并研究其致病性、耐药性以及spaA基因遗传进化关系。16S rRNA基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,结果显示分离株YN19071与猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)模式菌株ATCC 19414~T同源性99.9%,对小鼠有较强的致病性。spaA基因进化分析显示,YN19071与10株猪丹毒杆菌中国分离株之间的同源性为98.8%~99.5%,与疫苗株G4T10同源性为99.3%。与疫苗株G4T10相比较,云南分离株YN19071的spaA基因存在3个突变位点T609G、A635G和A671G,对应的氨基酸序列也存在3个突变位点I203M、E212G和E224G。本研究在首次对云南猪丹毒杆菌spaA基因遗传进化分析,对云南猪丹毒杆菌的疫苗免疫防控具有指导意义。

红斑丹毒丝菌SpaA的分段克隆及表达

为筛选表达量高且免疫原性强的红斑丹毒丝菌表面保护性抗原A(SpaA)的抗原片段,本研究根据该菌SpaA的结构和功能区将其设计为6个子片段和1个全长片段,采用PCR技术从红斑丹毒丝菌HG-1菌株中扩增出SpaA的7个抗原基因片段,利用原核表达系统克隆并表达后采用SDS-PAGE和western blot检测表达及纯化情况。结果显示,获得7个重组蛋白,分别命名为rSpaA1~rSpaA7,其表达量占菌体总蛋白的17.44%~25.38%,其中rSpaA1、rSpaA2、r SpaA5以包涵体形式表达,r SpaA3以可溶性蛋白形式表达,而rSpaA4、rSpaA6、rSpaA7两种表达形式同时存在。纯化后,rSpaA1~rSpaA7的纯度介于84.22%~93.72%,浓度为0.89 mg/mL~3.25 mg/mL。Western blot结果显示,7个重组蛋白均显示出良好的反应原性,其中rSpaA1、rSpaA3、rSpaA4的反应原性更强。本研究实现了对红斑丹毒丝菌SpaA的分段及其全长的表达和纯化,为SpaA保护性抗原片段的筛选及猪丹毒亚单位疫苗的研发奠定基础。

骆驼重组SpaA-N单域抗体的制备与性质研究

目的:获得特异识别SpaA-N的单域抗体。方法:用His-SpaA-N重组抗原从新疆双峰驼单域抗体噬菌体展示文库中,筛选SpaA-N的结合子。经测序后亚克隆至pET30a并在E.coli BL21高表达,用镍离子亲和层析柱纯化。ELISA分析重组单域抗体的热稳定性,Western blot检测结合特异性。结果:经His-SpaA-N筛选富集后,筛选得到2个目的克隆。构建至pET30a,PCR和酶切鉴定目的基因大小与预计相符。SDS-PAGE显示,Mr 29 000和23 000有特异性目的条带。ELISA检测显示,抗SpaA-N的VHH对SpaA-N重组蛋白具有很好的结合活性;VHH热变性后,经室温复性均可以恢复其抗原结合活性。Western blot显示,重组VHH在Mr 66 000处可以识别丹毒丝菌中存在的表面蛋白。结论:获得了具有热稳定性和特异结合SpaA-N的单域抗体,为进一步研究spaA抗原在丹毒丝菌感染免疫中的作用提供了基础。

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和HindⅢ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.

猪丹毒丝菌spaA基因的敲除及其致病作用的初步研究

为阐明SpaA在猪丹毒丝菌致病中的作用,以临床分离的猪丹毒丝菌野生强毒株为材料采用DNA重组技术构建spaA基因敲除载体,并利用该敲除载体通过同源重组敲除强毒株的spaA基因,比较强毒株和敲除株对小鼠毒力的差异.结果表明敲除株相比野生株对小鼠的毒力降低102倍,这说明SpaA与猪丹毒丝菌的致病性有关.

猪丹毒杆菌表面抗原SpaA的原核表达纯化及免疫原性验证

本研究制备了一种具备优良免疫原性的猪丹毒杆菌表面抗原重组蛋白。采用基因调取的方式,构建质粒并亚克隆到表达载体pET28a上,进一步将改造质粒转化到大肠杆菌感受态BL21细胞中,构建了1株猪丹毒SpaA全基因重组表达菌株。之后通过IPTG诱导表达、镍离子层析柱分离纯化、梯度透析获得高纯度重组SpaA蛋白。经免疫攻毒试验验证,重组SpaA蛋白能够有效保护小鼠和猪免于猪丹毒杆菌强毒攻击,其中小鼠的重组SpaA蛋白最小免疫剂量为每只2.0μg,100μg的重组SpaA蛋白能够保护猪免于猪丹毒杆菌强毒株感染。以重组SpaA蛋白作为组分与猪多杀性巴氏杆菌病活疫苗共同免疫小鼠,结果显示该混合疫苗对于猪丹毒杆菌及猪多杀性巴氏杆菌均有良好的保护效果。本研究结果证实,重组SpaA蛋白是我国现行猪丹毒杆菌传统灭活疫苗升级换代的理想候选抗原,同时也具备良好的抗原相容性,其高纯度及低免疫剂量的特点也为其他组分提供了充足的剂量空间。

猪丹毒丝菌spaA基因原核表达产物的免疫保护作用研究

本研究利用原核表达系统表达猪丹毒丝菌spaA基因并鉴定表达产物的免疫保护作用。根据猪丹毒丝菌临床毒株SG7 spaA基因序列设计引物扩增无信号肽的spaA基因,与表达载体pGEX-4T-1连接;将测序鉴定正确的重组载体转化BL21(DE3)大肠杆菌细胞,诱导表达后采用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定;经GST亲和层析柱纯化后的spaA蛋白免疫小鼠;对免疫小鼠采用猪丹毒丝菌毒株进行攻毒,统计小鼠死亡数,计算免疫保护率。结果表明,无信号肽的猪丹毒丝菌spaA基因成功插入表达载体pGEX-4T-1,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌细胞,经诱导后成功表达大小为97 ku目的蛋白。表达产物经纯化后免疫小鼠能激发机体的良好免疫,对猪丹毒丝菌毒株的感染能提供完全保护,结果可为猪丹毒spaA亚单位疫苗开发提供参考。

猪丹毒杆菌的分离鉴定及其SpaA基因的遗传变异分析

为确定导致福建某猪场猪只发病的病原,从病猪心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验及PCR鉴定,确定为猪丹毒杆菌。SpaA基因测序结果表明该分离菌在第609位点处出现了由胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,对应的氨基酸是由甲硫氨酸突变为异亮氨酸。致病性试验结果表明,2.1×108 CFU/mL的菌液10倍稀释后,感染28日龄健康昆明小鼠,该分离菌对28日龄健康小鼠的半数致死量为2.1×103.5 CFU/mL,死亡小鼠的剖解病变表现为心肌有白色坏死点,肝脏实变、坏死,肺出血和脾脏梗死等,并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对青霉素、红霉素、氨苄青霉素、强力霉素、先锋霉素、阿奇霉素等较为敏感。

红斑丹毒丝菌SpaA抗原基因的克隆、序列分析及蛋白结构预测

参照红斑丹毒丝菌表面抗原A(SpaA)基因的核苷酸序列合成1对引物,对我国生产用红斑丹毒丝菌CVCC43005的SpaA全基因进行了PCR扩增,扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,SpaA基因全长1 881bp,含有1个开放性阅读框,编码626个氨基酸。与已提交的红斑丹毒丝菌血清型1a、1b、2a、2b、5、8、9、12、15、16、17、N型的氨基酸同源性为97.5%～100%,血清型4、6、11、19、21的氨基酸同源性为52.8%～55.2%。与已提交的丹毒丝菌血清型18的氨基酸同源性为57.5%～58.0%。采用Chou-Fasman和Karplus-Schulz方案预测蛋白质的二级结构和柔性区域;运用Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性,按Jame-son-Wolf方案预测抗原指数,利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。对预测结果综合分析,推测最有可能的B细胞表位位于N端的59～64、85～91、174～186、193～201、212～215、221～231、266～275、278～288、291～308、314～327、329～349、356～376、403～456、508～516、528～537、568～576和607～626。