Radiogenotoxicological effect of signal nuclide ^(134)Cs on somatic and germ cells

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FGFs/FGFRs及其介导信号通路基因的异常表达影响犏牛未分化精原细胞增殖活性

旨在研究FGFs(fibroblast growth factors)/FGFRs(fibroblast growth factor receptors)及其介导的Ras和MAPK信号通路基因在牦牛和犏牛未分化精原细胞的差异表达,以探讨犏牛生精停滞的原因。本研究采集健康的24月龄3头公麦洼牦牛和3头F1代公犏牛的睾丸组织,分为牦牛和犏牛两个样品组,每组3个生物学重复。采用HE染色检测牦牛和犏牛精子发生的差异;采用细胞群体倍增时间、CCK-8和EDU染色检测牦牛和犏牛未分化精原细胞增殖能力的差异;采用荧光定量PCR检测6种FGF家族成员、3种FGFR、FGFs/FGFRs介导的Ras和MAPK信号通路基因在牦牛和犏牛未分化精原细胞中的差异表达。与牦牛相比,犏牛生精小管发育异常,生殖细胞类型单一,未分化精原细胞增殖活性显著低于牦牛(P<0.05)。FGF2、FGF4、FGF5、FGF8、FGF9和FGF21在犏牛睾丸组织及FGFs受体FGFR1、FGFR2和FGFR3在犏牛未分化精原细胞的表达都显著低于牦牛(P<0.01)。FGFs/FGFRs介导Ras信号通路基因中,除HRas和ARaf以外,其余基因(Raf1、BRaf、MEK1和ERK)都是在犏牛未分化精原细胞中以更低的水平表达(P<0.01)。FGFs/FGFRs介导MAPK信号通路基因中,p38、MEKK3、MEKK6和ASK1也是在犏牛未分化精原细胞中低表达(P<0.01)。受Ras通路调控的与细胞增殖相关的基因中,只有SHISA6、ID4在犏牛未分化精原细胞中高表达(P<0.01),其余基因(TAF4B、Etv4、GFRα1和Ret)都是在牦牛未分化精原细胞中表达量高(P<0.01)。受Ras和MAPK通路共同调控的与细胞增殖相关的基因中,ETV5和BCL6B都是在牦牛未分化精原细胞中高表达(P<0.01)。受Ras通路调控的与细胞分化相关的基因中,除PIWIL4外,SOX3、NGN3和Stra8都在牦牛未分化精原细胞中高表达(P<0.01)。因此FGFs/FGFRs及其介导的Ras和MAPK通路基因在犏牛未分化精原细胞中的异常表达,降低了未分化精原细胞增殖活性,导致了犏牛没有足够数量的未分化精原细胞进入分化阶段。这可能是犏牛生精停滞的重要原因之一。

睾酮对新生期大鼠支持细胞和精原细胞Adamts16表达的影响

[目的]研究睾酮对新生期大鼠支持细胞和精原细胞中血小板反应蛋白解整合素金属肽酶16(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs 16,Adamts16)基因表达的影响,以及Adamts16基因与大鼠隐睾的关系。[方法]利用RT-qPCR技术检测不同浓度睾酮(10-6、10-7、10-8、10-9 mol/L)培养大鼠支持细胞和精原细胞6、12、24 h后Adamts16基因的mRNA相对表达量,确定睾酮诱导支持细胞和精原细胞Adamts16基因mRNA表达的最佳剂量和最佳时间。应用HE染色法观察出生2、4、8 d野生型和Adamts16基因敲除型大鼠的睾丸位置。[结果]用10-6 mol/L睾酮诱导大鼠支持细胞6 h时Adamts16基因的mRNA相对表达量最高。用10-7 mol/L睾酮诱导大鼠精原细胞24 h时Adamts16基因mRNA相对表达量最高。与野生型大鼠相比,Adamts16基因敲除大鼠睾丸下降速度减缓。[结论]睾酮可促进新生期大鼠睾丸支持细胞和精原细胞Adamts16基因的mRNA表达;Adamts16基因缺失会引起大鼠隐睾症。

高龄小鼠来源精原干细胞长期培养体系的建立

目的建立高龄小鼠精原干细胞(SSC)体外长期培养体系。方法将5只8月龄昆明白小鼠用于本实验,组织形态学技术评估睾丸生精状态;优化睾丸体细胞去除流程、原代和传代中饲养层与生长因子组合条件,观察小鼠SSC克隆形成、增殖与传代;细胞生物学与分子生物学技术检测小鼠SSC克隆的干细胞特征。结果高龄小鼠睾丸精曲小管存在生精损害,PLZF^(POS)精原细胞数量增加;优化实验条件后富集的精原细胞数量增加,体外成功培养传代高龄小鼠SSC克隆6个月;高龄小鼠SSC克隆具有AKP活性并表达THY-1、PLZF、OCT-4等精原干细胞标记物。结论本研究通过优化消化、富集、原代和传代培养的多个环节,成功建立高龄小鼠SSC体外长期培养体系。

红景天多糖对精原干细胞体外增殖的影响

背景:体外建立快速、有效的培养方法以获得满足临床治疗应用的精原干细胞,是进行精原干细胞移植有待解决的主要问题。目的:探讨红景天多糖对精原干细胞体外增殖的影响。方法:无菌条件下从小鼠睾丸组织中分离精原干细胞和Sertoli细胞,将精原干细胞接种于Sertoli细胞饲养层上共培养后分为3组,分别为实验组1(单纯细胞培养基),实验组2(细胞培养基+150 mg/L红景天多糖)和实验组3(细胞培养基+150 mg/L红景天多糖+1 U/L白血病抑制因子+10μg/L胶质细胞源神经营养因子)。共培养7 d后,采用流式细胞术检测细胞体外增殖状态,计算细胞活性率以及精原干细胞已知抗原标志物GFRa-1、Thy-1和C-kit的阳性表达率。结果与结论:(1)共培养7 d后,细胞生长迅速,细胞生长形态呈集落样和葡萄串样,细胞团数量增加明显,符合精原干细胞的增殖特征。(2)精原干细胞中的GFRa-1、Thy-1和C-kit蛋白均表达于细胞膜和细胞质中,主要表达于细胞膜中。(3)精原干细胞活性率、GFRa-1阳性率、Thy-1阳性率:实验组3>实验组2>实验组1,组间两两比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。(4)C-kit阳性率:实验组1与实验组2之间相比较,差异无显著性意义(P>0.05),实验组3高于实验组1及实验组2,差异均有显著性意义(P<0.05)。(5)结果表明,红景天多糖单独或与白血病抑制因子、胶质细胞源神经营养因子联合应用,能增强精原干细胞体外增殖能力。

小鼠实验性隐睾诱发生殖细胞类型变化

利用 3 0～ 3 5日龄昆白系小鼠制作实验性隐睾 ,定期分批朴杀取样 ,检查隐睾组织学及生殖细胞群体变化 ,为生殖细胞富集及提高体内精原干细胞转基因效率提供条件和依据。结果表明 ,盆腔隐睾精子发生被阻断于精子形成阶段 ;经历 1 5d以上 ,曲细精管内精子数量较少 ;腹腔隐睾精子发生被阻断于精原细胞向精母细胞过渡阶段 ;经历 3 0 d以上 ,曲细精管仅由精原细胞、少量精母细胞及支持细胞组成。由此可知 ,制作盆腔隐睾 。

精原细胞分化过程中c-kit mRNA和蛋白的表达

目的探讨不同发育阶段大鼠睾丸内c-kit的表达特点。方法采用RT-PCR、免疫组化、Western blot方法分别检测1日龄、9日龄、1月龄大鼠睾丸内c-kit mRNA和蛋白的表达,并进行半定量分析。结果1日龄、9日龄和1月龄大鼠睾丸内均有c-kit mRNA和蛋白的表达,9日龄组大鼠睾丸内c-kit mRNA表达水平(0.2040±0.0048)和蛋白表达水平(3.7263±0.0087)显著高于1日龄组(0.0825±0.0071,2.4270±0.0982)和1月龄组(0.1034±0.0064,2.6532±0.1150)大鼠(均P<0.01),1日龄组与1月龄组c-kitmRNA和蛋白表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论c-kit的表达与精原细胞分化有直接关系,c-kit是精原细胞走向分化的标志。

脐带间充质干细胞在精原细胞培养条件下的生殖细胞特性

目的研究人脐带华尔通胶来源的间充质干细胞(MSCs)在精原细胞培养条件下向精原细胞方向分化的潜能。方法采用组织块贴壁法获得MSCs,取第3代MSCs分组进行诱导培养:对照组用基本培养液培养,实验组用条件培养液培养。用倒置显微镜和扫描电镜观察对照组和实验组细胞的外部形态差异;透射电镜观察2组细胞内部的超微结构变化;免疫组织化学方法检测2组细胞是否表达精原细胞的标记物CD117及CD49f;Western blot进一步检测2组细胞表达精原细胞特异性标记物CD49f的情况。结果以人脐带华尔通胶为原料培养获得的贴壁细胞高表达MSCs相关的标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记,并可以维持在未分化状态稳定生长、增殖;实验组细胞形态发生了明显变化,由成纤维细胞形变为圆形,并发现极少数变圆的细胞继续分化呈形似蝌蚪状,对照组细胞形态不发生类似变化,超微结构也显示了很大的差异;免疫组织化学证实实验组细胞表达精原细胞的标记物CD117、CD49f,而对照组细胞不表达CD49f,CD117弱阳性表达;Western blot进一步证实人脐带MSCs诱导前不表达精原细胞标记CD49f,而诱导后表达CD49f。结论用组织块贴壁法获得人脐带来源的MSCs,在精原细胞培养条件下进行诱导培养,不仅能发生精原细胞样的形态变化及伴发细胞的分化过程,而且能表达精原细胞的特征性标记,证实人脐带来源的MSCs具有向精原细胞方向分化的潜能。

温度对体外培养精原细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨精原细胞最适培养条件并观察环境温度对体外培养的精原细胞增殖和凋亡的影响。方法:将分离、富集的小鼠精原细胞分别置于不同温度条件下进行体外培养,观察其贴壁、增殖、形态学变化和存活时间;MTT法检测精原细胞活性,Annexin V-FITC/PI染色法检测精原细胞的凋亡。结果:32℃、34℃、37℃条件下均可以看到精原细胞的贴壁、分裂和增殖,39℃培养条件下,精原细胞极少贴壁,基本看不到细胞增殖,细胞很快发生凋亡。随着培养时间延长,精原细胞增殖形成的精原细胞克隆数和精原细胞存活时间明显不同,其中34℃条件下精原细胞增殖最多,存活时间最长。结论:温度对体外培养的精原细胞的增殖和凋亡有明显的影响,34℃为精原细胞体外培养的最适温度。

大鼠Sertoli细胞与精原细胞的分离及共培养

目的分离纯化14d大鼠Sertoli细胞与精原细胞,用Sertoli细胞作为饲养层对大鼠精原细胞进行体外培养研究。方法酶消化法制备大鼠睾丸组织单细胞悬液,采用牛血清白蛋白(BSA)不连续密度梯度沉降法分离Sertoli细胞和精原细胞。结果经分离的Sertoli细胞与精原细胞的纯度分别达到92.73%和78.36%。Sertoli细胞与精原细胞共培养,可见精原细胞发生分裂增殖等行为。结论在添加EGF、bFGF和GDNF等细胞因子的10%胎牛血清DMEM/F12培养基中,精原细胞能够存活一定时间;而Sertoli细胞表现为旺盛的生长状态,并可促进精原细胞的分裂与增殖。

骨髓间充质干细胞的分离培养及在精原细胞培养条件下生物学特征的观察

目的体外分离、培养、纯化小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并观察MSCs在精原细胞培养条件下的生物学特征,为体内诱导MSCs分化为精原细胞奠定基础。方法①分离5～6周龄的BALB/c小鼠胫骨、股骨,冲出骨髓,以Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法分离、培养、纯化MSCs;②通过动态观察、苏木精伊红(HE)染色、透射电镜观察、免疫组化检测细胞表面标记等鉴定MSCs;③用ELISA法检测MSCs培养上清中白细胞介素6(IL6)、IL8、粒细胞集落刺激因子(G CSF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子的相对含量,与相应对照组比较;④取第3代MSCs,分组进行诱导培养观察,对照组用基本培养液培养MSCs,实验组用条件培养液诱导培养MSCs。通过显微镜下动态观察、HE染色、免疫组化等方法观察诱导结果。结果①获得纯化的MSCs;②动态观察培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,HE染色细胞呈梭形,透射电镜观察细胞较幼稚,免疫组化检测细胞表面标记CD44、CD90呈阳性,从而鉴定了MSCs;③MSCs培养上清中IL6、IL8、G CSF、SCF等的含量显著高于对照组(P<0.05);④实验组细胞形态发生变化,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阳性;对照组细胞形态不变,CD29、CD117和Oct4免疫组化染色阴性。结论①用Percoll密度梯度离心法和贴壁法相结合的方法可获得纯化的MSCs;

Percoll非连续梯度法分离未成年绵羊精原细胞的研究

为探索一种简单可行的分离未成年绵羊精原细胞的方法,采用0.3%的胰蛋白酶消化新鲜采集的4～6月龄未成年绵羊睾丸组织,制备单细胞悬浮液,经Percoll非连续梯度法离心分离,得到自下而上3条清晰的细胞带,用流式细胞仪对各层细胞进行倍性和抗体染色鉴定.结果表明:第一层细胞中的精原细胞含量达到了76.76%,形态良好,活率高于96%.表明试验中所采用的分离方法对未成年绵羊睾丸精原细胞的分离效果较好,所得细胞可用于进一步的研究.

新生昆明小鼠睾丸支持细胞和精原细胞的共培养及支持细胞的作用

目的分离、纯化、培养小鼠睾丸支持细胞,通过与精原细胞共培养,研究体外培养的支持细胞对精原细胞的影响。方法用复合酶消化、密度梯度离心和差异贴壁法分离、纯化、培养新生小鼠睾丸支持细胞,以苏丹Ⅳ染色鉴定支持细胞;用丝裂霉素-C处理支持细胞后作为饲养层,与精原细胞共培养;以直接分离培养的精原细胞作对照。倒置相差显微镜观察,细胞培养第3天,四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定精原细胞的增殖率;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/磷脂酰肌醇（ANNEXIN-Ⅴ-FITC/PI）染色;激光扫描共焦显微镜观察记录精原细胞的凋亡率,比较精原细胞克隆大小、存活时间、增殖率和凋亡率的不同。结果分离、纯化后经苏丹Ⅳ染色鉴定的小鼠支持细胞纯度可达95%以上,与支持细胞共培养的精原细胞的克隆大小、存活时间和细胞增殖率明显高于对照组,而凋亡率则明显低于对照组。结论支持细胞可以促进精原细胞的增殖,抑制其凋亡。

达兰猪精原干细胞的分离、纯化和初步鉴定

对达兰仔猪睾丸精原细胞及精原干细胞进行了体外分离、纯化和初步鉴定。对8d达兰仔猪的睾丸实质组织，采用Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶和胰酶组合消化法分离精细管细胞，制备单细胞悬液，用Percoll不连续密度（11％、19％、27％、35％和43％）梯度法纯化精原细胞；对纯化后的细胞培养12h，细胞贴壁后进行碱性磷酸酶（AKP）染色鉴定，初步确定精原千细胞及其比例。结果表明：所获精细管细胞悬液中活细胞和死细胞所占的比率分别为92．65％和7．35％，平均每克睾丸可获得4．17×10^7个细胞；精原细胞主要分布于19％～27％的Percoll梯度带中，经纯化后其纯度为47．62％，精原千细胞占该带细胞的比例为5．52％。因此，采用组合酶消化，结合Percoll不连续密度梯度离心法分离的达兰仔猪的精原细胞不但能够满足体外培养的需要，还可以做为精原千细胞移植的研究材料。

SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响

目的探讨SET蛋白对精原细胞株GC-1spg增殖和凋亡的影响。方法使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基在37℃、5%CO2条件下培养GC-1spg细胞,分对照组(转染无关序列腺病毒)和实验组[转染SET干涉腺病毒(AdH1-siRNA/SET)];GC-1spg接种于96孔板或者6孔板,转染腺病毒48h、72h后收集细胞,免疫荧光和共聚焦激光扫描显微镜检测SET蛋白在GC-1spg细胞中的表达与定位;提取细胞总蛋白,Western Blot检测转染前后SET蛋白的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记法检测细胞的数目和增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。结果 SET蛋白表达于GC-1spg细胞的胞核和胞浆中,且胞浆分布多于胞核;转染SET干涉腺病毒后,干涉组GC-1spg细胞中的SET蛋白相对表达量为(0.217±0.044)显著低于对照组的(0.629±0.170)(P<0.05),同时GC-1spg细胞的数目减少,增殖减慢,且细胞凋亡率显著增加[干涉组(21.663±1.287)%,对照组(8.813±0.671)%](P均<0.01)。结论SET蛋白在精原细胞GC-1spg胞核和胞浆中均有表达,且胞浆分布多于胞核;GC-1spg细胞中SET蛋白表达降低,能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,提示SET蛋白可能参与调节精子发生的过程。

精原细胞异基因移植研究进展及其面临的困惑

将供体精原细胞移植入异基因受体生精小管中,可看到供体精原细胞分化形成供体形态特征的精子。伴随着冷冻保存、体外培养和干细胞富集技术的发展,精原细胞异基因移植必将在基础科学、临床医学、动物繁殖等领域有非常重要的应用前景。另外,这些技术也可用于接受大剂量放疗或化疗的肿瘤患者的性腺保护和生育力保存。本文综述精原细胞异基因移植研究进展,并对该技术在今后临床应用中所存在的问题进行讨论。

局部照射和全身照射诱发小鼠精原细胞染色体畸变的比较

本文对X线照射小鼠睾丸组织和全身均匀照射诱发精原细胞染色体易位率进行了比较。两种不同照射方式所诱发的易位率都随剂量增加而增高,其剂量效应关系均符合y=a+bD关系式。全身照射明显高于局部受照,从而提示用全身均匀照射的遗传风险来估价睾丸组织受照的遗传效应是不适宜的,它过高的估价了遗传危险度。因此对常见的生殖器官局部受照的遗传危害,应该用局部照射的资料来评估,更接近实际。

精原细胞分化与凋亡的影响因素

人们对哺乳动物精子发生过程已经有了相当多的了解,但对精子发生过程的调控机制仍然了解甚少。生殖激素及原癌基因和肿瘤抑制基因的表达产物对维持正常精子发生中各类细胞的存活、增殖和凋亡,以及各类细胞受损伤后的清除均具有十分重要的作用。本文论述了促卵泡激素、雌激素、雄激素、干细胞因子、Bcl-2家族蛋白及p5 3蛋白在原细胞的分化和凋亡中的作用。

复方硝基酚钠诱发小鼠骨髓细胞和睾丸精原细胞染色体畸变的观察

研究了鱼虾促生长药物添加剂复方硝基酚钠对体细胞和雄性生殖细胞的致突变性。骨髓细胞染色体畸变分析以每公斤体重用２５０、８３．３、２５ｍｇ的复方硝基酚钠分别给小鼠经口染毒，每日１次，连续５ｄ，同时设空白对照组和阳性对照组。睾丸精原细胞染色体畸变分析以每公斤体重用２５０、１２５、６２．５ｍｇ的复方硝基酚钠给雄性小鼠经口染毒，每日１次，连续５ｄ，同时设空白对照组和阳性对照组。上述两种致突变试验结果均为阴性。

TRAP-SYBR-Green染色法检测大鼠睾丸组织内端粒酶活性的实验研究

目的 研究不同年龄SD大鼠睾丸组织内端粒酶活性表达及其意义。方法 应用TRAP SYBR Green染色法 ,对各年龄组健康雄性SD大鼠睾丸组织中端粒酶活性进行了检测 ,并结合光镜、电镜观察对端粒酶活性在不同年龄SD大鼠睾丸组织内的表达状况进行了研究。结果 从出生后第 1d直到第 2 7个月 ,各年龄组雄性SD大鼠的睾丸组织中均可检测到端粒酶活性的表达 (阳性率 10 0 % )。出生后第 9～ 39dSD大鼠睾丸中可检测到高水平的端粒酶活性。A型精原细胞表达高水平的端粒酶活性。结论 SD大鼠睾丸组织中终生表达端粒酶活性 ,A型精原细胞作为雄性生殖系统的干细胞 。