利用改良SOE-PCR技术定点突变TuMVC4-VPg基因

芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,Tu MV)是白菜类蔬菜生产上的重要病害,其中Tu MV VPg基因在Tu MV侵染白菜类蔬菜的过程中起着至关重要的作用,且不同Tu MV株系的致病性不同。本试验采用改良的重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术,以Tu MV C4-VPg基因序列为模板,定点突变Tu MV C4-VPg与Tu MV CDN1-VPg基因间5个差异核苷酸位点(决定5个氨基酸差异)。结果表明:通过SOE-PCR技术获得了5个Tu MV C4-VPg基因的单点突变体,即Tu MV C4-VPg-Ⅰ、Tu MV C4-VPg-Ⅱ、Tu MV C4-VPg-Ⅲ、Tu MV C4-VPg-Ⅳ和Tu MV C4-VPg-Ⅴ。

SOEing法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,SOEing)构建含有杜氏盐藻(Dunaliella salina)硝酸盐还原酶(NR)基因5′-上游序列(Pnr)and 3′-端序列(Tnr)的EGFP真核表达载体,并将其转化杜氏盐藻。利用改进的SOEing法,将杜氏盐藻NR基因Pnr与报告基因EGFP cDNA融合,并与pEGM-7zf克隆载体连接,顺序将盐藻NR基因Tnr序列与融合片段相连,构建含Pnr-EGFP-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NET。电击法转化杜氏盐藻,在盐藻转化株中观察到了EGFP的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了实验基础。

Magainin和cecA-mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

选用毕赤酵母偏爱密码子 ,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin基因和cecA mil杂合肽基因全长分别为 1 0 1bp和 60bp ,并在其N端引入kex2裂解位点 ,以保证表达抗菌肽具有天然N端。其中 ,cecA mil杂合肽基因根据cecropinAN端第 1～ 7个氨基酸残基、melittinN端第 5～ 1 2个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZα A质粒 ,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα A mag和pPICZα A CM。在AOX1 (醇氧化酶 )启动子调控下 ,类似天然抗菌肽大小的magainin及cecA mil蛋白获得分泌表达 ,其表达量分别为 1 0 5mg L和 1 1 8mg L。初步抑菌活性测定 ,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coliDH5α有较好的抑杀活性。

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。

猪α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究

为了研究高效广谱的猪基因工程抗病毒制剂,作者采用重叠延伸PCR(Splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头(linker)(G4S)3将猪α干扰素(Porcine interferon alpha,PoIFN-α)与猪白细胞介素2(Porcine interleukin-2,PoIL-2)成熟肽基因连接,构建成PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因,并克隆入pGEM-T Easy载体,将PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体进行原核表达。通过尿素变性、复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rPoIFN-α-linker-PoIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中的PoIFN-α在不同细胞系上对不同病毒增殖活性的抑制作用;分别采用MTT法和PoIL-2 ELISA试验方法检测rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白中PoIL-2的生物学活性。结果表明成功构建并克隆PoIFN-α-linker-PoIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中得到高效表达,表达的rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白相对分子质量约36.7 ku,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白在细胞上具有与单一rPoIFN-α蛋白相近的抑制病毒增殖活性,其中在PK-15细胞上抗VSV的活性单位为1.891×104I U.mL-1,在Marc-145细胞上抑制高致病性PRRSV增殖的活性单位为905 U.mL-1;rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有与单一rPoIL-2蛋白对照相近的生物学活性,可明显促进CTLL-2细胞的增殖,并可与抗PoIL-2单抗发生特异性免疫反应。这表明rPoIFN-α-linker-PoIL-2蛋白具有rPoIFN-α和rPoIL-2蛋白双重的生物学活性,为基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗等研究奠定了基础。

bFGF与VEGF抗原表位筛选及复合肽的表达鉴定

目的筛选bFGF与VEGF抗原表位,构建复合肽进行原核表达,并对复合肽免疫原性及抑瘤效果进行研究。方法生物信息学方法分别预测bFGF和VEGF抗原表位,筛选优势表位,通过柔性Linker连接各表位构建复合肽,合成引物,重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)方法合成复合肽cDNA序列,克隆入原核表达载体pET32a进行表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western-Blot鉴定,Ni-NTA柱纯化复合肽并免疫小鼠,间接ELISA法测定抗bFGF抗体和抗VEGF抗体滴度。构建黑色素移植瘤C57BL/6小鼠模型,研究复合肽免疫后肿瘤生长情况。结果生物信息学方法筛选获得3个bFGF表位和2个VEGF表位连同一个噬菌体多肽库筛选表位构建成复合肽,SOEPCR方法成功合成复合肽cDNA序列,构建原核表达载体表达bFGF与VEGF复合肽,纯化的复合肽免疫小鼠产生抗bFGF抗体和抗VEGF抗体;并且体内能有效抑制黑色素瘤生长。结论生物信息学方法筛选bFGF和VEGF获得的抗原表位构建的复合肽在体内同时激发抗bFGF抗体和抗VEGF抗体,并且能抑制肿瘤的生长,为研究bFGF与VEGF表位的抗肿瘤作用奠定基础。

利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2 Bnap全长cDNA序列

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理 ,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增 ,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cD NA序列。

大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定

利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。

采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库

目的 构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法 从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度 (1:10 2 4 )的人全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经RT PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区 ,再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区 (Cκ)和重链恒定区 (CH1) ,将轻链可变区和轻链恒定区 (Cκ)及重链可变区和重链恒定区 (CH1)进行第 1次基因拼接 ,分别形成κ轻链和Fd重链 ,再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第 2次基因拼接 ,形成完整的Fab基因 ,与pComb3H SS噬菌体质粒连接后 ,电穿孔转化大肠杆菌XL1 Blue。结果 通过多次电穿孔转化 ,获得总容量为 4× 10 5库容的噬菌体抗体库。

鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用

构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入E.coli TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。

重组PCR技术研究进展和应用

重组PCR是用聚合酶链反应体系来实现DNA重组的技术。经过20多年的发展,该技术已形成三个各具特色的方法分支:重叠延伸拼接、跳跃PCR和DNA重排。近几年,以利用天然的差异基因作为重组来源为目的,通过简化操作步骤、提高捕获变异的效率、借助于表面展示技术和荧光探针技术搭建的高通量筛选平台,重组PCR技术在基础研究和工程应用研究的众多领域中的实用价值不断增加。

重叠延伸PCR法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用RT-PCR法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸PCR法(splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、PCR、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸PCR法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。

重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用

目的 :将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶 (h PL AP- 1) C末端信号肽序列进行拼接 ,形成融合基因。方法 :利用重叠区扩增基因拼接法 ,分别扩增 h PLAP- 1C末端信号肽序列和 SEA基因序列。然后 ,将二段基因拼接并与 p GEM- T克隆载体连接 ,酶切和测序鉴定。结果 :成功扩增出 h PLAP- 1C末端信号肽序列 131bp和 SEA基因序列 796 bp;经测序证实 ,二段基因序列成功拼接 (90 1bp)。结论 :重叠区扩增基因拼接法能将 SEA基因与 h PL AP- 1C末端信号肽序列拼接 ,形成融合基因。

重叠区扩增法合成抗菌肽B基因

人工设计并合成了抗菌肽 B基因的 4个寡聚核苷酸片段 ,通过重叠区扩增法 ,扩增出了相当于抗菌肽基因全长的寡聚核苷酸片段。经克隆测序 ,证明成功地实现了抗菌肽基因的人工合成、拼接和克隆。

第60～80位氨基酸多肽片段缺失的HCV核蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)第6080位氨基酸多肽缺失核蛋白的真核表达载体,并在真核细胞中表达.方法:用RTPCR方法从西安地区丙型肝炎患者血清中扩增HCVC区及部分E1区基因并进行克隆、测序,以此为模板用重叠延伸拼接方法扩增第6080位氨基酸多肽基因缺失的核蛋白基因片段(C510),将其定向克隆入哺乳动物高效表达载体pCIneo中,通过Lipofectamine2000转染入p815细胞,经间接免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜和WesternBlotting方法检测细胞中目的蛋白的表达.结果:从患者血清中成功克隆出HCVC区基因,序列及系统发生树分析结果显示为1b型;测序结果显示构建的第6080位氨基酸多肽缺失核蛋白基因的重组真核表达质粒pCI510基因序列准确;免疫荧光和免疫印迹方法均证实目的蛋白p170可在p815细胞中表达.结论:重组体pCI510构建正确,其目的基因在p815细胞中可有效表达,为进一步的研究奠定了基础.

抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达

目的 构建抗转铁蛋白受体 (TfR)单链抗体原核表达载体 ,为进一步研究其效应奠定基础。方法 从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体 pGEM T VH和 pGEM T VL中扩增重链可变区 (VH)和轻链可变区 (VL)基因 ,用重叠延伸PCR的方法 ,在VH和VL基因间引入连接短肽 (Linker) ,构建VH Linker VL的单链抗体 (singlechainFv ,scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上 ,转化和筛选后 ,阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法 (IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果 凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约 70 0bp条带 ,SDS PAGE鉴定表达产物的分子量为 2 7kD左右 ,与scFv的理论值一致 ,IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论 本研究成功地构建并表达了抗人TfRscFv ,为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。

乙型肝炎病毒基因生物信息学分析及特异片段的制备

目的制备HBV基因分型芯片模板。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对,选取6个碱基位点作为分型位点,应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing法)对C型HBV片段进行点突变。结果在所选位点上成功引入点突变。结论SOEing法是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型检测基因所需的模板DNA。

利用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因构建dsRNA原核表达体系

大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得了RNaseIII缺失型菌株M-origami。利用电激法,将构建的TMV运动蛋白基因(movement protein gene,MP)的dsRNA表达载体LMP480导入M-origami菌株中,IPTG诱导表达的结果显示:构建的M-origami/LMP480原核表达系统能高效表达TMV运动蛋白基因的dsRNA。初步的抗病性鉴定显示,表达的dsRNA能够诱发烟草对TMV的抗性。

修饰GLP2分泌性表达载体的构建及促增殖活性测定的实验研究

目的对胰高血糖素样肽-2(glucagon-like peptid-2,GLP-2)进行基因修饰,观察其促细胞增殖活性。方法通过RT-PCR方法获得含GLP2编码序列的高血糖素原cDNA片段;通过PCR重叠延伸技术得到GLP2信号肽及成熟肽的嵌合分子,并将编码GLP2成熟肽N-末端第二位丙氨酸的序列(GCT)突变为编码甘氨酸的序列(GGT);将其插入真核表达质粒pVITRO3,转染至肠上皮细胞(Caco-2),观察其对细胞增殖活性的影响。结果克隆的修饰GLP2基因与国外报道的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列完全一致,并成功拼接GLP2的信号肽及成熟肽;且加入pVITRO3-GLP2-Caco-2培养上清的细胞生长明显快于对照组。结论PCR重叠延伸技术适用于分泌性载体构建。构建的修饰GLP2表达系统所表达的蛋白具有促进肠上皮细胞增殖的作用。

人角质细胞生长因子的植物表达载体构建

人角质细胞生长因子(KGF)有3个外显子,2个内含子．以人 DNA 为模板,PCR 扩增获得角质细胞生长因子外显子2和外显子3；合成单链的寡核苷酸,经链延伸和 PCR 扩增从而获得外显子1．应用延伸 PCR 将3个外显子连接得 KGF 编码序列,并连接 CaMV35S 启动子和 NOS 终止子后克隆至植物表达质粒 pBI 1301．