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DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建
1
作者
蔺增曦
王胜兰
+1 位作者
杨秀山
杨克迁
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2008年第11期1924-1930,共7页
以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的...
以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应,生成环化的DnaB-N蛋白。将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置,转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽(含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库。随机挑取20个克隆,测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列;挑取其中9个克隆进行表达,结果表明可产生大量的融合蛋白,90%的融合蛋白在16oC表达20 h后发生体内剪接。将在30oC表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化,通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量。
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关键词
split
ssp
dnab
mini—
intein
环肽库
自我剪接
下载PDF
职称材料
TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能
被引量:
1
2
作者
朱甫祥
宫贤弟
+3 位作者
刘泽隆
杨树德
屈慧鸽
迟晓艳
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第12期1710-1716,共7页
CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(...
CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(TMD2)前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分,与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合,分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1,构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接,并用膜片钳技术记录Cl-通道电流。结果显示,基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带,膜片钳记录到全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因,为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体(AAV)转运CFTR基因,克服AAV的容量限制提供了依据。
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关键词
CFTR
Cl-通道
split
ssp
dnab
intein
蛋白质反式剪接
双载体基因转移
原文传递
题名
DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建
1
作者
蔺增曦
王胜兰
杨秀山
杨克迁
机构
首都师范大学
中国科学院微生物研究所
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2008年第11期1924-1930,共7页
文摘
以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应,生成环化的DnaB-N蛋白。将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置,转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽(含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库。随机挑取20个克隆,测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列;挑取其中9个克隆进行表达,结果表明可产生大量的融合蛋白,90%的融合蛋白在16oC表达20 h后发生体内剪接。将在30oC表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化,通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量。
关键词
split
ssp
dnab
mini—
intein
环肽库
自我剪接
Keywords
split
ssp
dnab
mini-
intein
, cyclic peptide, self-splicing
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能
被引量:
1
2
作者
朱甫祥
宫贤弟
刘泽隆
杨树德
屈慧鸽
迟晓艳
机构
鲁东大学生命科学学院
Department of Physiology & Biophysics
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第12期1710-1716,共7页
基金
山东省自然科学基金(No.ZR2010CM061)
烟台市科技计划项目(No.2008152)
+1 种基金
教育部留学回国人员科研启动基金(No.2007[1108])
鲁东大学科研经费(No.LZ20083305)资助~~
文摘
CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(TMD2)前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分,与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合,分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1,构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接,并用膜片钳技术记录Cl-通道电流。结果显示,基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带,膜片钳记录到全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因,为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体(AAV)转运CFTR基因,克服AAV的容量限制提供了依据。
关键词
CFTR
Cl-通道
split
ssp
dnab
intein
蛋白质反式剪接
双载体基因转移
Keywords
CFTR
chloride ion channel
split ssp dnab intein
protein trans-splicing
dual-vector gene delivering
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建
蔺增曦
王胜兰
杨秀山
杨克迁
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2008
0
下载PDF
职称材料
2
TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能
朱甫祥
宫贤弟
刘泽隆
杨树德
屈慧鸽
迟晓艳
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010
1
原文传递
已选择
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