DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建

以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应,生成环化的DnaB-N蛋白。将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置,转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽(含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库。随机挑取20个克隆,测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列;挑取其中9个克隆进行表达,结果表明可产生大量的融合蛋白,90%的融合蛋白在16oC表达20 h后发生体内剪接。将在30oC表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化,通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量。

TMD2前断裂CFTR翻译后的连接及氯离子通道功能

CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病——囊性纤维化(CF)。利用split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术的真核细胞双载体转CFTR基因,旨在研究翻译后水平CFTR的连接,以及由其建立的氯离子通道功能。于CFTR膜内第2个跨膜结构域(TMD2)前的Glu838密码子后将其cDNA断裂为N端和C端两部分,与具有蛋白质反式剪接作用的split Ssp DnaB intein编码序列融合,分别插入到载体pEGFP-N1和pEYFP-N1,构建一对真核表达载体pEGFP-NInt和pEYFP-IntC。用脂质体将这对载体共转染至幼年仓鼠肾细胞(BHK),瞬时表达实验用Western blotting观察CFTR蛋白质的连接,并用膜片钳技术记录Cl-通道电流。结果显示,基因共转染细胞呈现完整的CFTR蛋白条带,膜片钳记录到全细胞Cl-电流和单个Cl-通道开放活性。结果表明split Ssp DnaB intein的蛋白质反式剪接技术可用于双载体共转移CFTR基因,为CF基因治疗应用双腺相关病毒载体(AAV)转运CFTR基因,克服AAV的容量限制提供了依据。