玉米淀粉分支酶SBEⅡb基因RNA干涉表达载体的构建和转化

应用聚合酶链式方应技术扩增玉米淀粉分支酶第20外显子155 bp的基因片段,并将其正向和反向克隆到pUCCRNA i载体上。利用pHMW.GUS与pCAMB IA1300作为桥梁载体,构建了含胚乳特异启动子和潮霉素筛选基因的RNA干涉表达载体pCAMB IA1300+HMW+2F。通过三亲杂交将pCAMB IA1300+HMW+2F表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404,对玉米自交系178进行遗传转化,通过抗性筛选和PCR检测,获得了4株PCR阳性苗。

水稻sbe1启动子驱动的反义sbe-GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究水稻基因启动子对外源基因在转基因水稻中表达的影响 ,构建了由sbe1启动子引导的反义sbe GUS融合基因。经农杆菌介导 ,将不同的融合基因导入水稻中 ,定量测定转基因水稻植株不同组织中的GUS酶活力。结果表明 ,sbe1启动子可驱动反义sbe GUS融合基因在转基因水稻植株的胚乳中高效表达 ,而在颖壳、胚和茎叶等组织中的表达活性较弱。证实sbe1启动子在驱动外源基因的表达上表现有明显的组织特异性。

复合酶法改性糯麦A-、B-型淀粉及对其结构和消化特性的影响

以从糯麦淀粉中分离所得的A-、B-型淀粉为研究对象,并以此作为受体,高直链玉米淀粉为供体,利用普鲁兰酶和分支酶协同处理对糯麦淀粉进行改性,测定其颗粒形态、结晶结构以及表观直链淀粉含量、溶解度、膨胀力等理化性质,并对其消化特性进行考察。结果表明:采用普鲁兰酶和分支酶两种复合酶法改性的糯麦A-、B-型淀粉,其预测血糖指数显著降低,表观直链淀粉含量显著增加、溶解度随着温度的增加而变大,膨胀力随着温度的增加基本保持不变。采用扫描电子显微镜观察到酶法改性后的淀粉颗粒形态出现孔洞结构,利用X射线衍射和傅里叶红外光谱分析相对结晶度和1047 cm^(-1)/1022 cm^(-1)处的比值可得,复合酶改性淀粉的长程有序结构和短程有序结构显著改善。通过普鲁兰酶预处理后再用分支酶改性,对糯麦A-型和B-型淀粉进行结构修饰,能够显著改善其消化特性。

应用RNA干扰技术降低玉米支链淀粉含量

为了调控玉米淀粉的生物合成过程,克隆了玉米淀粉分支酶(starchbranchingenzymes,SBE)基因,构建高效的siRNA表达体系,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系。PCR扩增和Southern杂交结果证明,目的基因已被整合到基因组中,且能够遗传。Northern杂交分析表明,该目的基因在转基因植株中能正常转录并导致内源SBEmRNA含量下降。对转基因植株淀粉分支酶活性和淀粉含量测定结果表明,分支酶活性明显地低于对照,相差最多的低85%;总淀粉含量与对照之间基本没有差异,但直链淀粉的含量提高了约50%。

玉米淀粉分支酶基因片段的克隆和植物表达载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行了PCR检测和限制性内切酶分析,测定了DNA全序列。结果表明:克隆片段全长为935bp。将反义+正义基因片段插入到pBI12135S启动子下,构建成表达质粒pCJSBE2b。通过花粉管通道法将其导入玉米自交系,获得了转基因植株。

植物支链淀粉生物合成研究进展

植物支链淀粉占贮存淀粉的70％～80％,是决定植物果实或种子品质的关键成分。对植物支链淀粉生物合成途径及其代谢酶基因的研究,可大大推动支链淀粉结构的改造和在食品工业上的应用。该文介绍了植物支链淀粉的结构组成,详细阐述了参与支链淀粉生物合成的三类酶,即淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)、可溶性淀粉合酶(soluble starch synthase,SSS)和淀粉脱支酶(starch debranching enzyme,SDBE)的编码基因、酶学特性及其在支链淀粉合成中的作用,并就植物支链淀粉的合成模型加以探讨。同时提出了该研究领域尚待解决的问题,对其应用前景作了展望。

玉米淀粉分支酶基因的克隆和反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术穴PCR雪扩增了玉米淀粉分支酶的cDNA基因片段,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了DNA全序列。结果表明:克隆片段全长为1698bp。将该基因反向插入到pCAMBIA1301的CaMV35S启动子之后,构建了反义表达载体。

木薯分支酶活性测定及同工酶电泳技术应用初探

淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)是唯一引入α-1,6糖苷键分支点,催化支链淀粉形成的酶,影响淀粉分支程度及淀粉粒的精细结构。本文以3个亲缘关系较远的高产木薯品种(SC124、SC8、Arg7)为材料,利用SBE同工酶电泳及酶活性检测观察木薯块根支链淀粉增长较快时期SBE活性变化动态,结合支链淀粉含量检测分析木薯淀粉同工酶表达特点与支链淀粉积累的关系。结果表明:种植后140d至180d为木薯单株支链淀粉含量快速增加时期;SC124和SC8支链淀粉积累量早于Arg7达到高峰;Arg7各个时期的支链淀粉含量及SBE活性均表现最高。同工酶分析表明,木薯分支酶有SBE-I和SBE-II两个基因位点:SBE-Ι至少有3个等位基因位点(SBE-Ιa、SBE-Ιb、SBE-Ιc),品种间具有多态性;SBE-II为单一条带,但活性大小在品种间和发育不同阶段有差异。初步判定等位基因位点SBE-Ιc和SBE-II可能对SBE酶活性和支链淀粉含量贡献较大。

两阶段温度控制策略以及助剂促进淀粉分支酶的胞外表达

为了促进重组淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的胞外表达，对重组淀粉分支酶在摇瓶水平上进行了发酵优化。首先，以胞外酶活力为指标，先后考察了初始培养基、pH、培养温度和培养时间4种因素对胞外表达的影响；然后，通过两阶段温度策略和助剂的添加进一步提高胞外表达水平。结果表明，当发酵培养基为TB、pH为7．5时，25℃培养24h后胞外酶活力达到19．9U／mL；同时，菌体生长最适温度和酶分泌的最适温度是不一致的，通过两阶段温度控制策略（即0—12h控制温度30℃，12h后温度调至25℃），胞外酶活力与单一温度条件下的最高水平（25℃）相比提高了1．4倍，达到了47．1U／mL；在此基础上，进一步添加0．05％的吐温-80，将胞外酶活进一步提高40％，达到65．8U／mL。