SD大鼠外周血单个核细胞成分及干/祖细胞含量的年龄变化

目的:研究SD大鼠外周血单个核细胞(PBMNCs)的组成成分及其随年龄的变化,为大鼠PBMNCs相关研究提供参考。方法:使用淋巴细胞分离液、不连续密度梯度离心法制备3、6、12月龄雄性SD大鼠PBMNCs,检测PBMNCs中细胞种类和含量、淋巴细胞和单核细胞含量随年龄的变化趋势;流式细胞术、免疫荧光技术检测PBMNCs干/祖细胞含量及随年龄变化趋势。结果:使用淋巴细胞分离液,不连续梯度离心法制备PBMNCs,不同细胞成分分层清晰,红细胞、粒细胞去除较完全,PBMNCs中淋巴细胞、单核细胞含量随年龄的增长下降趋势明显;PBMNCs中Nanog、OCT4、SOX2、SSEA4四种干性标志物均有表达,Nanog阳性表达量最低,SSEA4表达量最高,可达23.1%;总体趋势均为6月龄大鼠PBMNCs中干/祖细胞含量最高。结论:SD大鼠PBMNCs中干/祖细胞含量较高,动物实验治疗疾病的作用可能较人体应用的疗效好。进行SD大鼠PBMNCs移植治疗疾病的实验研究,建议选用6月龄以下大鼠为宜。

电穿孔转染SD大鼠神经干细胞条件优化

目的以原代培养的SD大鼠神经干细胞为研究对象,优化电穿孔转染条件。方法通过设置不同的电压、脉冲时间、电压脉冲时间组合等电转染条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的靶向大鼠β-catenin基因的siRNA质粒导入SD大鼠神经干细胞,48 h后观察并比较神经干细胞的转染效率,确定最佳电转染条件。结果 300 V电压、60μs脉冲时间或300 V电压、80μs脉冲时间的转染条件下,SD大鼠神经干细胞可获得较好的转染效率,分别为(62.21±11.56)%和(53.34±9.0)%。结论电穿孔转染是一种高效的基因转染方法,通过条件的优化。

SD大鼠骨基质明胶吸附骨髓间充质干细胞修复骨缺损的实验研究

目的:探讨大鼠骨基质明胶吸附骨髓间充质干细胞修复骨缺损的可行性。方法:采用第5代(P5)SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),经Hoeschst 33344(sigma)荧光杂料标记后,调配制成的1×106个／ml细胞浓度后与骨基质明胶(BMG)共同培养6 h,然后植入SD大鼠双侧胫骨的实验性骨缺损中(A组),同时作胫骨骨缺损单纯BMG植入(B组),无植入物(C组)两组对照。术后8周处死,取骨缺损区组织进行组织学观察,其中A组行荧光染料标记测定以确认骨缺损区的骨痂是否来源于MSCS。结果:①A组:胫骨骨缺损区可见大量新生不规则骨纤维组织、软骨及纤维骨痂填充,可见骨细胞、骨组织和骨小梁,已形成骨髓腔。②B组:胫骨骨缺损区可见大量纤维组织、少量新生不规则骨纤维组织及骨骼肌组织,伴有多核巨细胞和少量炎性细胞,缺损区边缘带有骨痂组织。③C组:胫骨骨缺损区可见大量纤维组织及骨骼肌组织填充生长,伴有多核巨细胞和少量炎性细胞,缺损区边缘带有少量骨痂组织。荧光染色鉴定确认胫骨骨缺损区的骨痂来源于MSCs。结论:大鼠骨基质明胶吸附骨髓间充质干细胞修复骨缺损具有安全性、可行性及有效性。

无血清培养胆囊癌GBC-SD细胞形成肿瘤细胞球的鉴定

目的:分离扩增肿瘤干细胞,并鉴定其生物学性质.方法:用无血清培养基培养人胆囊癌GBC-SD细胞得到肿瘤细胞球.将肿瘤细胞球传代扩增,并用含血清培养基培养促使其分化;将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别种入96孔板,MTT检测增殖能力,并将肿瘤球和普通GBC-SD细胞分别植入裸鼠皮下,观察移植瘤的形成;流式细胞术检测CD15s和CD24在肿瘤球细胞和普通GBC-SD细胞中的表达,筛选细胞表面标志物.结果:在无血清培养基中,胆囊癌细胞可以形成少量的肿瘤细胞球,并显示很强的自我更新和增殖能力,含血清环境能够诱导其分化而贴壁生长;在动物实验中,肿瘤球细胞较普通GBC-SD细胞显示更强的致瘤能力(80.00%vs10.00%,P<0.05);标志物CD15s在肿瘤球的表达较普通GBC-SD细胞明显增高(2.56%±0.38%vs10.77%±0.93%,t=18.25,P<0.05).结论:人胆囊癌细胞GBC-SD的肿瘤干细胞可以通过无血清培养环境来分离和扩增,CD15s可能为其细胞表面标志物.

CD133、Nestin在成年SD大鼠室管膜下区的表达

目的探讨CD133、Nestin在成年SD大鼠室管膜下区的表达。方法应用免疫组织化学法检测成年SD大鼠室管膜下区CD133和Nestin的表达。结果成年SD大鼠室管膜下区存在大量CD133、Nestin阳性细胞,其主要分布于侧脑室外侧壁,尤其以上外侧壁为甚。侧脑室内侧壁CD133阳性区域厚度为(15.22±1.12)μm,外侧壁厚度为(45.02±1.31)μm,最厚处以侧脑室上外侧壁为甚,为(88.33±5.09)μm。其中侧脑室内侧壁Nestin阳性区域厚度为(17.4±1.31)μm,外侧壁厚度为(48.10±1.37)μm,外侧壁厚度为(101.76±3.75)μm。经统计学分析,室管膜下区各部位CD133阳性区域厚度值显著小于Nestin阳性细胞区域。结论成年SD大鼠室管膜下区存在CD133、Nestin表达阳性的神经干细胞,CD133、Nestin在室管膜下区分布不均,主要聚集于侧脑室外侧壁,尤其上外侧壁。

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞rMSCs的方法,检测传代细胞的细胞周期,并分析部分细胞表型,对rMSCs进行初步的鉴定。方法:密度梯度离心结合贴壁培养法分离培养rMSCs,传代扩增,倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原,流式细胞仪检测细胞周期。结果:密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞呈均一的成纤维细胞样,细胞周期显示90.16%P1代细胞处于G0/G1期,免疫组化结果为:CD44、CD29阳性、CD34阴性,说明培养的细胞即非造血干细胞,也非成纤维细胞。结论:本实验分离培养的细胞群与间充质干细胞的生物学特性吻合,说明密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化rMSCs,细胞稳定表达CD44、CD29,是实用、可行的方法,所培养的细胞可用于细胞移植等研究。

SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法的研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离培养的适宜条件。方法取1、2、4个月大鼠各6只,分离MSCs,以0.5×105/m l、1×105/m l、2×105/m l密度接种,通过倒置显微镜观察MSCs增殖情况,绘制生长曲线。流式细胞仪观察细胞周期并绘制细胞周期图。结果利用贴壁法成功培养出MSCs并能使之分裂增殖,但随着传代次数的增加,增殖能力有所下降。在培养过程中大鼠年龄要控制在2月以内,接种密度以1×105/m l适宜。结论贴壁培养法是一种简便易行的培养MSCs方法,操作简单,成功率高,可以作为培养SD大鼠MSCs常规方法。

冻存SD大鼠脂肪组织中脂肪干细胞的分离培养和鉴定

目的研究从冻存SD大鼠脂肪组织中分离培养脂肪干细胞(ADSC)的可行性。方法取健康SD大鼠股沟处脂肪组织,用100 m L/L二甲基亚砜联合900 m L/L胎牛血清(FBS)作为冻存剂,冻存于液氮中。3个月后复苏冻存的脂肪组织,进行ADSC的分离培养,观察细胞的生长状况及形态特征。取第3代细胞,CCK-8法绘制其生长曲线,免疫荧光技术检测CD29、CD45、CD90的表达;分别用成脂、成骨诱导培养液进行诱导分化,油红O、茜素红染色鉴定细胞分化情况。结果从冻存SD大鼠脂肪组织中分离得到的ADSC形态为长梭形纤维样,具有较好的增殖能力,生长曲线为典型的"S"型;免疫荧光技术证实细胞强表达CD29、CD90,CD45阴性;分离的细胞经成脂诱导后油红O染色为阳性,经成骨诱导后茜素红染色为阳性。结论从冻存SD大鼠脂肪组织中能够分离出ADSC。

热环境及主导管结扎后SD大鼠下颌下腺内Integrinα_6 β_1 及CD90.1阳性细胞增殖的比较

目的:比较热环境与主导管结扎后SD大鼠下颌下腺内Integrinα6β1、CD90.1阳性细胞的增殖能力。方法:15只SD大鼠平均随机分为3组(n=5)。加热组大鼠在(34.5±1)℃环境饲养48 h;结扎组下颌下腺主导管结扎6 d;正常组予正常环境饲养。实验终点时摘除双侧下颌下腺腺体行组织学观察;流式细胞术分析腺体中Integrinα6β1、c-Kit、CD90.1阳性细胞百分比。结果:加热组下颌下腺体积重量最大,结扎组最小。流式细胞检测加热组、结扎组、正常组腺体内Integrinα6β1阳性细胞数分别为(26.2±2.4)%、(16.9±2.6)%、(10.6±0.7)%(P<0.05),CD90.1阳性细胞分别为(33.0±5.4)%、(25.0±4.1)%、(18.1±3.4)%(P<0.05),c-Kit阳性细胞分别为(13.4±3.4)%、(13.8±3.0)%、(8.5±3.1)%,加热组与结扎组无明显差异(P>0.05),但均明显高于正常组(P<0.05)。结论:热环境比主导管结扎更能有效刺激下颌下腺内Integrinα6β1和CD90.1阳性细胞的增殖,但对刺激c-Kit阳性细胞增殖没有明显差异。

SD大鼠经鼻腔给予神经干细胞方法初探

目的:采用大鼠鼻腔给药,建立可模拟干细胞给药新途径的临床前给药方法,为开展干细胞临床前安全性评价奠定基础。方法:将32只Sprague Dawley(SD)大鼠,随机分为2组:溶媒对照组、受试物组,每组16只动物,雌雄各半。采用鼻腔给药法,溶媒对照组给予生理盐水,受试物组给予人源神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs),给药剂量为1×107 cells·kg-1。于给药后24 h和6 d,对大鼠实施麻醉后暴露心脏,完成心脏采血并进行心脏灌流固定,取脑(纹状体、黑质、皮层、海马、小脑)、血、心、肝、脾、肺、肾、睾丸及附睾(雄性)、卵巢(雌性),脏器、组织进行固定,取材后进行免疫荧光试验,研究神经干细胞在上述组织器官中的分布情况。结果:大鼠鼻腔给予神经干细胞后24 h和6 d,脑组织的纹状体、黑质、皮层、海马、小脑部位均可见神经干细胞分布。外周组织心、肝、脾、肺、肾、睾丸及附睾(雄性)、卵巢(雌性)、外周血均未见有阳性细胞。结论:临床前研究表明,神经干细胞可以通过鼻腔给药方式吸收入脑治疗脑部疾病。

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞。方法全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成骨、成脂肪诱导分化鉴定其多向分化潜能。结果大鼠BMSCs体外培养生长状况良好,可见BMSCs呈均一的梭形和多角形。流式细胞仪检测显示BMSCs表达CD29、CD90,不表达CD34、CD45。经体外诱导后具有多向分化潜能。结论全骨髓贴壁培养法适合体外分离、扩增和纯化大鼠BMSCs,培养的大鼠BMSCs具有间充质干细胞的一般生物学特性,为后续基因修饰BMSCs及其体内移植实验奠定良好的基础。

SD大鼠间充质干细胞的分离培养及生物学特性初探

目的:探讨体外分离培养、纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的方法,明确增殖及生长特征。方法:从骨髓中提取间充质干细胞,加入淋巴分离液后用密度梯度离心培养法和静止贴壁培养法,分离纯化大鼠骨髓MSCs,对其进行传代扩增和形态学观察,细胞计数,绘制生长曲线。结果:(1)通过离体培养,可使体内环境下低丰度的骨髓间充质干细胞实现数目扩增;(2)体外单层培养条件下贴壁生长的骨髓间充质干细胞大多数具有成纤维细胞生长特性。结论:对比两种分离方法可知淋巴分离法更有利于骨髓间充质干细胞的纯化,体外培养成功为今后进一步利用体内间充质干细胞研究细胞衰老,并建立衰老模型奠定了基础。

SFE法和SD法提取木贼挥发油化学成分的比较分析

分别采用超临界CO2萃取(SFE)法和水蒸气蒸馏(SD)法提取木贼挥发油,用GC-MS法进行成分鉴定,用归一法测其相对含量。SFE法提取木贼挥发油的出油率为2.10%,SD法提取木贼挥发油的出油率为0.86%。超临界CO2萃取法提取物鉴定出61个成分,占总成分的22.2%;水蒸气蒸馏法提取物鉴定出43个成分,占总成分的19.6%。超临界CO2萃取法提取植物挥发油具有产率高、产品质量好、提取速度快等特点,适用于中草药挥发油的化学成分分析。

体外培养SD大鼠与BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性比较

目的观察SD大鼠和BALB/c小鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外培养情况及生物学特性,评估两种BMMSC分离、纯化及扩增的能力。方法全骨髓法联合差速贴壁培养法分离、纯化及扩增SD大鼠和BALB/c小鼠BMMSC;倒置相差显微镜观察BMMSC原代及第3代细胞形态及生长过程,HE染色观察第3代细胞形态,细胞计数法绘制第3代细胞生长曲线观察细胞增殖情况;流式细胞术检测第3代细胞表面CD29、CD44、CD45、CD34;第3代BMMSC经成骨诱导液诱导3周后,用茜素红染色检测BMMSC的分化能力。结果倒置相差显微镜观察SD大鼠骨髓细胞原代培养的细胞集落形成时间早于BALB/c小鼠,原代及第3代SD-BMMSC集落细胞呈纺锤形,大小较一致,集落形成快且较多,呈鱼群状,而BALB/c-BMMSC较杂,有圆形、三角形或梭形,细胞较小,集落少,呈霜花状; HE染色显示SD-BMMSC集落较BALB/c-BMMSC更为典型,呈鱼群状,细胞形态较为均一;两种BMMSC第3代细胞生长曲线均近似"S"型,但SD-BMMSC增殖能力较好;两种第3代BMMSC经成骨诱导培养3周后,经茜素红染色均可见有矿化结节,但SD-BMMSC形成的矿化结节较明显;第3代两种BMMSC表面标志CD29、CD44均高表达,CD34均低表达,而CD45在SD-BMMSC低表达,在BALB/c-BMMSC高表达。结论全骨髓法联合差速贴壁培养法可成功分离、纯化及扩增SD大鼠和BALB/c小鼠BMMSC,而SD-BMMSC体外分离培养、纯化及扩增更易更快,且获得的BMMSC纯度高。

体外培养SD大鼠神经干细胞多向分化的实验研究

目的 分离培养SD大鼠神经干细胞（NSCs）,诱导分化,为神经干细胞的分化研究提供基础实验依据.方法 分离新生24小时内SD大鼠端脑及中脑,采用无血清培养技术进行NSCs体外扩增培养及传代.对NSCs及其分化后的细胞进行nestin、GFAP、NF 200免疫细胞化学染色.结果 分离培养的细胞增殖活性好,6～7天后生长成由上百个细胞组成的大克隆球,nestin呈阳性表达.经诱导分化后,克隆球间存在网络状结构,GFAP和NF 200呈阳性表达.结论 实验中分离培养的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具有向星形胶质细胞和神经元等方向分化的多向分化潜能.

化学致癌剂3’-甲基-4-DAB影响巢蛋白Nestin在SD大鼠肝卵圆细胞中的表达

目的:采用免疫组化方法标记大鼠肝卵圆细胞中巢蛋白Nesin的表达,探讨肝卵圆细胞新的表面标记蛋白。方法:用化学致癌剂3’甲基4二甲基氨偶氮苯(3’Methy4dimethylaminoazobenzen,3’meDAB)喂养SD大鼠4周,取大鼠肝脏,用免疫组化法标记神经前体细胞的特异性表面标记物巢蛋白Nestin在大鼠肝卵圆细胞中的表达。结果:汇管区靠近界板处卵圆细胞表达Nestin阳性,Nestin阳性细胞成簇状分布或呈双层排列成管状,主要集中在赫令氏管周围。并见Nestin阳性细胞向肝小叶内迁移,散在分布于肝细胞索。结论:大鼠肝内存在Nestin表达阳性的卵圆细胞,Nestin可能是肝卵圆细胞新的标记蛋白。

基于不同提取方法的汉麻茎叶精油全组分鉴定及比较研究

以汉麻茎叶为原料,分别采用水蒸馏提取法、亚临界萃取法以及超临界萃取法来获得汉麻精油,比较不同提取方法下获得的精油全组分的差异性、特征性。采用气相色谱-质谱法(GC-MS)对精油全组分进行鉴定分析,并通过NIST质谱库和人工解析对所提取成分进行鉴别分析和相似度的检索,最后根据峰面积归一化法得出这三种提取方式下汉麻精油各组分的相对含量。三种提取方法下所得精油组分差异性明显,共计鉴定出154个成分,且含有13个共有成分,相似度均在80%以上。其中水蒸馏提取法共鉴定出89种,含量最高组分是大麻二酚(19.69%);亚临界萃取法鉴定出62种,含量最高组分是邻苯二甲酸二正辛酯(17.56%);超临界萃取法鉴定出59种,含量最高组分是油酸(22.50%)。三种方法所得精油组分种类和含量均有不同程度的差异:水蒸馏法获得的精油组分种类最多,多为烷烃、烯烃、醇类、醛类、倍半萜类等小分子化合物,而亚临界法和超临界法在一定程度上具有相似性,二者共有40个共有成分,多为酸类,醇类,酯类,酚类等高沸点化合物或大分子化合物,但含量差异明显。

水蒸气蒸馏法和同时蒸馏萃取法制备新疆产罗马洋甘菊油及成分比较

采用水蒸气蒸馏法和同时蒸馏萃取法提取了新疆产罗马洋甘菊挥发油,通过GC-MS方法分析了两种油的主要化学成分,并比较它们的差别。两种油中均含有大量的萜烯类、醇类、酮类、酸类和酯类化合物。特别是其中的酯类化合物,使得油拥有突出的花香和果香香韵。两种方法相比,同时蒸馏萃取法的得油率相对较高,对于小分子单萜、水溶性较好的化合物有更高的提取效率,而化学成分上的差别造成不同方法制备的油在香韵上的差异。

不同方法提取的蓝布正挥发油的化学成分研究

目的:对3种不同方法提取的蓝布正挥发油的化学成分进行分析研究。方法:采取水蒸气蒸馏(SD)法、同时蒸馏萃取(SDE)法和微波萃取(MAE)法3种方法提取蓝布正挥发油,用 GC-MS 分析其化学成分。以 HP-5MS 毛细管柱为分离柱,程序升温从50℃(保持2 min)开始以4 ℃·min^(-1)。升到180℃,再以9℃·min^(-1)升到290℃,保持5 min,气化室温度250℃,载气为高纯氦气(1.0 mL·min^(-1))。结果:通过计算机检索,共鉴定出58个化合物。结论:SD 法和 SDE 法提取的挥发油成分相似,MAE 法与前2种方法提取的挥发油化学成分有差异。

气相色谱和热重技术应用于模拟蒸馏的研究进展

针对油料，特别是煤焦油普通蒸馏存在的耗时长、样品量大、过程污染严重等弊端，评述了气相色谱、热重技术应用于模拟蒸馏方面的研究进展，旨在探索焦油模拟蒸馏的快速、简捷、准确的实用方法。