甾醇C-22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到酵母菌甾醇C-22去饱和酶基因(ERG5)的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pYPE5。以铜离子螯合蛋白基因CUP1替换ERG5基因内部序列获得ERG5破坏菌株YSE5,其中麦角甾醇的合成被阻断,而积累了甾醇中间体Ergosta-5,7-dien-3β-ol。表达质粒pYPE5转化破坏菌株后使细胞恢复了合成麦角甾醇的能力。说明表达质粒上的ERG5基因得到了功能性的表达。将表达质粒pYPE5转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,通过营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pYPE5)。对重组菌株、破坏菌株和互补菌株细胞甾醇组分和含量进行测定,发现重组菌株和互补菌株的麦角甾醇和总甾醇含量明显低于对照菌YS58(YEp352)。测定不同培养时间细胞的麦角甾醇含量,发现重组菌株的麦角甾醇含量始终低于对照菌YS58(YEp352)。可见,ERG5在酵母中的高表达导致细胞麦角甾醇含量降低。