恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-Sta56经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白,为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。

恙虫病东方体Karp株56-kDa外膜抗原基因片段的原核表达及免疫原性研究

目的探讨恙虫病东方体56-kDa蛋白在大肠埃希菌中的表达及作为诊断性抗原的可行性。方法用PCR扩增恙虫病东方体Karp菌株编码56-kDa蛋白长约1 100bp的DNA,克隆至表达载体pET30a(+)。表达产物经SDS-PAGE、质谱分析及western blot鉴定分析。重组蛋白质纯化后作为包被抗原,用方阵实验确定最佳浓度包被,ELISA法检测其与立克次体目16种成员及10种致病菌阳性血清的反应性。用此重组蛋白质免疫小鼠后制备抗血清,分别用ELISA及间接免疫荧光法(IFA)检测抗血清的效价。结果重组质粒经PCR及测序分析证明,56-kDa外膜抗原的基因片段以正确的读码框连入到pET30a(+)质粒载体中,SDS-PAGE结果表明重组蛋白质在约46-kDa处有表达的目的条带,western blot分析显示该条带可与1∶1 600稀释的兔抗Karp血清反应,证实其具有免疫活性。质谱分析鉴定该蛋白质为恙虫病东方体56-kDa蛋白;方阵滴定确定选择抗原的最佳稀释度为1∶1 600,特异性分析结果表明,重组蛋白质除与查菲埃立克体、嗜吞噬细胞无形体及五日热巴尔通体存在弱交叉反应外,与其他细菌均无交叉反应。IFA及ELISA检测表明抗血清效价可达1∶1 600。结论构建的重组蛋白质可以作为恙虫病东方体快速诊断的抗原。

实时荧光定量PCR技术的优化及其在恙虫病东方体诊断中的应用

目的建立一种优化的实时荧光定量PCR技术,并用于诊断粤北山区恙虫病东方体(Ot)基因型。方法采用优化实时荧光定量PCR技术对感染Ot的患者和鼠类的血液和组织标本检测Ot DNA载量并分析其基因型,并与未优化实时荧光定量PCR和巢式PCR的检测结果进行比较。结果采用优化实时荧光定量PCR技术检测660例发热患者,有224例检测到Ot,其中108例是发热5d内的早期患恙虫病患者,以及在55份鼠类的标本中有12份能检测到感染Ot,均为Gilliam型;未优化实时荧光定量PCR在患病7d以上才能检测到Ot。同时,在鼠类基因扩增片段还显示出与Gilliam、Karp、Kato3株国际参考株不同,经巢式PCR分型证实为Kawasaki型,与巢式PCR基因分型的结果相符。结论优化实时荧光定量PCR技术可作为早期诊断恙虫病的实验方法,用于快速分析Ot基因型,适合在基层医院推广应用。

新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体调查

目的调查新疆部分地区人群及动物感染恙虫病东方体(Ot)情况,并对媒介昆虫进行调查。方法采用多种方法捕获可能感染Ot动物取脾,当地牧民静脉取血,从野鼠体表捕获恙螨,用试剂盒提取DNA,应用巢式PCR(nPCR)检测Ot-Sta56基因;接种昆明小白鼠进行Ot病原传代分离。结果共采取人群血液2430份,在6份血液中检测并分离到Ot;捕获动物13种5783个(只),从5种啮齿动物(小家鼠、灰仓鼠、大砂土鼠、草原兔尾鼠、灰旱獭)、2种鸟类(麻雀、灰腹鹡鸰)的脾中检测并分离到Ot,从绵羊血液中检测到Ot。其他动物体内未检测到Ot。从野鼠体表分离恙螨5种,从博乐纤恙螨体内检测分离到Ot。基因序列分析表明,新疆地区存在恙虫病东方体的基因型以Karp型为主,可能存在Saitama型。结论新疆地区存在人群及动物感染Ot,其基因型以Karp为主,可能存在Saitama型。