通过玻璃化超低温处理脱除草莓轻型黄边病毒(SMYEV)研究

以草莓品种明宝为材料,取茎尖做初代培养,继代扩繁5次后,取2mm左右的茎尖,利用玻璃化超低温技术对SMYEV进行脱除,并利用结合内标的多重RT-PCR技术对再生植株进行病毒检测。结果表明,在病毒脱除过程中,预培养蔗糖浓度为0.5mol/L,处理3d;装载处理为25℃,60min;玻璃化处理为0℃,120min;液氮处理60min后,进行40℃水浴2min,草莓茎尖的存活率为76%,而草莓轻型黄边病毒的脱除率为95%。只有通过液氮处理才可以脱除该病毒,液氮处理前的玻璃化处理脱毒率为0。利用超低温脱毒法可以简便有效地脱除SMYEV。

结合内标的RT-PCR技术检测草莓轻型黄边病毒(SMYEV)

草莓（FragariaananassaDuch）是蔷薇科（Rosaceae）草莓属（Fragaria）多年生草本植物。在长期的生产过程中，草莓同其他无性繁殖植物一样，易感染病毒，从而造成草莓品种的种性退化。草莓轻型黄边病毒（Strawberrymildyellowedgevirus，SMYEV）是危害草莓较为严重的一种潜隐性病毒，该病毒侵染草莓植株后，引起叶片边缘失绿，植株矮缩，叶片黄化、卷曲，强毒株还引起叶片枯死。

草莓轻型黄边病毒的RT-PCR检测及其3'端序列分析

利用RTPCR技术对草莓植株中草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的外壳蛋白基因片段进行特异扩增,扩增产物经测序证明为SMYEV的特异片段。建立了稳定的SMYEV的RTPCR检测体系,并对19个草莓品种和2种野生草莓进行检测,其中12个品种和五叶草莓带有SMYEV。从SMYEV的沈阳分离物SY01上扩增出了932bp的基因组3末端区域,其核酸序列与国外分离物的序列同源性为86%～96%。系统进化树显示SMYEV分为3个组群,沈阳分离物SY01与欧美分离物位于同一组群内,但独立形成1个小的分支。RNA二级结构分析显示SMYEV基因组3末端形成3个茎环结构,不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化。

草莓轻型黄边病毒RT-LAMP检测方法的建立

【目的】草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)是侵染草莓的重要病毒,严重影响草莓果实的产量和品质。研究旨在建立利用反转录等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测SMYEV的方法。【方法】根据SMYEV外壳蛋白基因3′端保守序列设计4个特异性引物SMYEV-FIP(5′-CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT-3′)、SMYEV-BIP(5′-GCTTTGTC GGGGATCCTGGGAAGGCTAAGTCGAAGAGACC-3′)、SMYEV-F3(5′-TCAAGTTGGTGACCCTTTCC-3′)和SMYEV-B3(5′-CGAGGAAC CAATGTCGTAGC-3′)。对RT-LAMP检测体系中的条件进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,反应时间为30、45、60、75 min,分别设置引物SMYEV-FIP/BIP浓度为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μmol·L-1,引物SMYEV-F3/B3浓度0.1、0.15、0.2、0.25、0.3μmol·L-1,设置Mg2+浓度为2、4、6、8、10 mmol·L-1,d NTPs浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol·L-1,betaine浓度为0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1,DTT浓度为2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0μmol·L-1等,并对以上不同反应条件进行检测,确定优化后的RT-LAMP检测体系。选用其他常见的草莓病毒以及健康草莓植株叶片中的RNA作为模板,对RT-LAMP体系的特异性进行测定;将SMYEV的RNA进行10倍梯度逐级稀释,分别获得RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7不同稀释液作为模板,比较RT-LAMP和RT-PCR的检测灵敏度。RT-LAMP反应产物可以进行电泳和紫外成像检测,阳性样品出现瀑布状条带,阴性样品无条带,或者在反应产物中加入SYBR green I核酸染料,直接观察检测,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了一种特异性检测SMYEV的RT-LAMP方法,经过各反应条件优化后的检测体系为1.0μmol·L-1SMYEV-FIP/BIP、0.1μmol·L-1 SMYEV-F3/B3、4 mmol·L-1 Mg2+、1.6 mmol·L-1 d NTPs、0.4 mol·L-1 betaine、2.0μmol·L-1DTT,60℃反应45 min。选用SMYEV、草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)、草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMo V)和草莓皱缩病毒(Strawberry crinkle virus,SCV)的RNA以及健康草莓植株叶片中的RNA作为模板进行RT-LAMP的特异性检测,结果显示仅有SMYEV的RNA能够扩增出瀑布型条带,建立的RT-LAMP检测体系有很好的特异性。将SMYEV的RNA原液、10-1、10-2、10-3稀释液作为模板进行RT-PCR反应后,检测结果为阳性,随着模板稀释倍数的增加,电泳检测不能观察到RT-PCR的扩增产物。而进行SMYEV的RT-LAMP检测时,RNA原液、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5稀释液作为模板时,均可以观察到阳性结果。RT-LAMP检测SMYEV比RT-PCR方法检测的灵敏度高100倍,并且比RT-PCR节省时间,检测结果容易判定。【结论】RT-LAMP方法能快速、简便、特异地检测SMYEV,供科研部门和基层生产单位使用,在种苗繁育、田间调查和海关检疫的过程中进行快速检测。

草莓轻型黄边病毒检测研究

本文对草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)的2种分子检测技术进行了比较研究。结果表明,多重PCR技术以草莓actin为内参基因,完全排除在实验中杂质与操作的影响。Real time PCR技术具有更高的灵敏度和可靠性,可以定量检测出样本中病毒粒子的含量。结果表明,Real time PCR的灵敏度是普通PCR的100倍以上,而多重PCR的检测成本更经济。所以Real time PCR技术将用于引进品种的检疫,而多重PCR技术将用于大规模的脱毒苗的检验。

草莓轻型黄边病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表达

克隆草莓轻型黄边病毒CP基因,并构建其原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达CP蛋白。利用SMYEV的检测引物,通过RT-PCR技术筛选带SMYEV的草莓植株;根据NCBI中SMYEV序列设计扩增CP基因全长引物,通过RT-PCR获得SMYEV沈阳分离物CP基因全长序列;将CP基因克隆到原核表达pGEX-6P-1上,利用IPTG诱导CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达蛋白。利用RT-PCR扩增获得SMYEV分离物SY05的CP基因全长序列,由729个核苷酸组成,编码242个氨基酸残基。SY05与其他SMYEV分离物的核苷酸同源性为80.1%～97.4%,氨基酸同源性为92.1%～99.6%,其中,与SMYEV分离物SY03的氨基酸一致性为98.3%。将SY05的CP基因成功克隆到原核表达载体pGEX-6P-1上,构建了重组表达载体p6P-EV-CP,并将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导SMYEV分离物SY05的CP基因在大肠杆菌中表达出分子量为52.0 kDa的融合蛋白。克隆出SMYEV分离物SY05的CP基因,实现了其在原核细胞中的表达,为SMYEV抗血清的制备奠定了重要基础。

利用原核表达的外壳蛋白制备草莓轻型黄边病毒抗血清

【目的】探索以原核表达的草莓轻型黄边病毒(SMYEV)外壳蛋白(CP)为抗原制备抗血清的方法,从而建立利用ELISA检测SMYEV的技术体系。【方法】利用IPTG诱导SMYEV CP重组蛋白在大肠杆菌中表达,分离纯化重组蛋白并以其为抗原对新西兰兔进行免疫。血清效价达到要求后,分离纯化抗血清并利用DAC-ELISA对草莓植株进行SMYEV检测,同时利用RT-PCR对DAC-ELISA检测结果进行验证。【结果】宿有SMYEV CP基因的大肠杆菌经IPTG诱导后出现一条52.0 ku左右的特异性重组蛋白谱带,以纯化的重组蛋白为抗原制备出专一性较强的针对SMYEV的抗血清,该抗血清稀释800倍后仍能有效检测草莓植株中的SMYEV。利用DAC-ELISA和RT-PCR对26份草莓试材分别进行SMYEV检测,2种检测方法的检测结果基本一致。【结论】以原核表达的SMYEV CP为抗原可以制备出专一性较强、效价较高的SMYEV的抗血清。

草莓轻型黄边病毒北京分离物的CP基因序列分析

为了明确引起北京地区草莓病毒病的病毒种类和病毒序列的分子变异特点,从北京地区表现畸形症状的草莓叶片中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV）的含有外壳蛋白（CP）基因的729 nt特异性核苷酸片段。经序列测定和分析可知,北京地区存在2种不同的SMYEV分离物（BJ1和BJ2）,两者间的核苷酸序列同源性仅为82.72%~82.96%。将北京分离物与分别来自德国、美国、智利、捷克、澳大利亚、比利时、意大利、韩国和中国沈阳等国家或地区的不同分离物的CP基因序列进行分析比较。结果显示,33个分离物可以分为四大组群,BJI和BJ2分别归属不同组群,BJ1与19个其他国家的分离物亲缘关系较近,BJ2与中国沈阳的2个分离物亲缘关系较近。BJ1和BJ2与其他分离物的CP基因核苷酸序列同源性分别为81.10%~98.35%和82.03%~98.63%,氨基酸序列同源性介于82.17%~99.17%和90.91%~94.63%。

草莓伪轻型黄边病毒的鉴定

从6省13市约18品种草莓样本、分离纯化并研究鉴定,初步证实辽宁、哈尔滨及南京一些栽培田,有草莓伪轻型黄边病毒(SPMYEV)的发生分布。在春香、宝交早生、丹东鸡心,诺宾卡及80-3.1等品种上发病。病样先以小叶嫁接技术,接于草莓UC-4、EMC及“Alpine”,约3～5周显症、下部叶片呈现黄色斑块,接UC-5、EMB不太敏感仅于老叶上现轻斑驳或褪绿斑,一种草莓中瘤钉毛蚜(Chaetosiphon sp.)及棉蚜(Aphis gossypii)作半持久性传播本病毒,桃蚜(Myzus persicae)不传播。UC-4对本病毒的繁殖、保存和嫁接鉴别最为适合,提纯病毒电镜观察其粒子线状,大小约630～680×12～13nm,县典型核蛋白吸收光谱,其最大吸收值位于2.63nm处;最小吸收值位于243nm处。A260/280=1.24。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,测其外壳蛋白分子量约为37,000d。病叶制做超薄切片也观察到线形晶状病毒粒子,分散或聚集于寄主的薄壁组织细胞质中。本病毒系国内首报。

草莓温和黄边病毒的蚜传特性、提纯及病毒粒体形态观察

对草莓温和黄边病毒(SMYEV)的症状学、介体传毒特性、提纯程序及病毒粒体的形态进行研究。发现一种草莓中瘤蚜(Chaetosiphon sp.)对SMYEV作持久性传播。棉蚜(Aphisgossypii)和挑蚜(Myzus persicae)均不传本病毒。草莓中瘤蚜可分离出SMYEV、接种蚜虫数量及蚜虫取食部位与传毒效率密切相关,10～15头传毒较高、取食幼叶和中部病叶传毒率较高。以小叶嫁接法培育繁殖本病毒于UC—4草莓上,取病叶榨汁,PEG沉淀,差速离心及蔗糖密度梯度离心等程序后,获得SMYEV的提纯制剂外。经紫外分光光度计检测呈典型的核蛋白吸收光谱,其A260/280=1.12。电镜检视病毒粒子球形,直径28～30nm。从病叶制做的超薄切片观察到直径23nm的球形粒子,集中分布于薄壁组织细胞质中,健株对照则无。

草莓伪温和黄边病毒提纯技术的研究

纯化的草莓伪温和黄边病毒(SPMYEV),小叶嫁接繁殖于指示植物草莓UC—4上,然后采样榨汁,结合聚乙二醇(PEG)沉淀,蔗糖垫底差速离心及连续性蔗糖密度梯度离心,能成功地将草莓伪温和黄边病毒提纯出来。经电镜观察为丝杆状病毒粒体,长×宽为650nm×12—13nm。提纯的病毒制剂,经紫外分光光度计测定,呈典型的核蛋白吸收曲线,其最大值位于263nm,最小值位于243nm。A260/A280=1.24,用冰醋酸分解病毒,提取衣壳蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量约37000道尔顿。

草莓伪温和黄边病毒抗血清制备及血清学检测技术研究

将提纯的草莓伪温和黄边病毒（ＳｔｒａｗｂｅｒｒｙｐｓｅｕｄｏｍｉｌｄｙｅｌｌｏｗｅｄｇｅｖｉｒｕｓＳＰＭＹＥＶ）作抗原免疫家兔，获得效价较高的抗血清，经ＳＤＳ－对流免疫电泳测其效价为１：１２８．四点疫吸附固定法检测ＳＰＭＹＥＶ效果甚理想，可检测到微量病素，提纯病毒浓度低至０．０５μｇ／ｍｌ仍有效果．酶联免疫吸附测定法检出灵敏度也相当高，当病毒浓度为０．１μｇ／ｍｌ时及病叶汁液稀释至１０２４倍时，仍呈阳性反应．免疫电镜技术检视，ＳＰＭＹＥＶ抗血清能清晰地”捕获”同源病毒，并且有装饰作用，抗血清以稀释为１：５００时“捕获”病毒粒子最多．

草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及其免疫原性分析

应用IEDB、DNAStar、DNAMAN和Snap Gene等生物信息学工具对草莓轻型黄边病毒外壳蛋白的氨基酸残基序列进行分析。选择一段抗原性较强的肽段(位于外壳蛋白27~38氨基酸残基处),依据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性化学合成了该肽段的DNA编码序列(AE)。AE片段克隆至E.coli表达载体pET32a(+)的Eco RⅠ和XhoⅠ位点,获得重组质粒pET32a(+)-AE。含AE片段的开放阅读框长561 bp,编码了一个187氨基酸残基的重组融合蛋白,理论分子质量为20.29kD。重组质粒pET32a(+)-AE分别在E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta中进行了诱导表达和条件优化。重组融合蛋白在E.coli Rosetta中的最佳表达条件为1.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、35℃诱导表达2 h,产率为13.22 mg/L;在E.coli BL21(DE3)中的最佳表达条件是为0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导表达2 h,产率为9.55 mg/L。重组融合蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱鉴定表明,其含有所预测的草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位肽段AE。AE重组融合蛋白经Ni^(2+)亲和色谱纯化、EK酶切、分子筛除去融合蛋白标签后,免疫产蛋鸡。从免疫鸡所产鸡蛋中提取鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,Ig Y),Dot-Blot检测抗体结合活性。结果表明,所提取的IgY可特异性识别AE肽段和SMYEV外壳蛋白。这一结果表明所预测的AE肽段具有较好的免疫原性。

不同热处理方式脱除草莓植株体内草莓轻型黄边病毒的研究

2014—2022年对红颜草莓的组培苗进行了RT-PCR检测,发现其主要受草莓轻型黄边病毒(SMYEV)、草莓镶脉病毒(SVBV)、草莓斑驳病毒(SMoV)、草莓皱缩病毒(SCV)和黄瓜花叶病毒(CMV)危害,阳性样品的总检出率为20.2%。2022年组培苗中仅检测出SMYEV和SVBV,以携带上述病毒的红颜匍匐茎为试材进行组织培养,SMYEV的脱除率为25.0%,SVBV的脱除率为100.0%。为进一步确定脱除SMYEV的有效方法,对带毒茎尖组培苗进行热处理,并通过RT-PCR和RT-qPCR检测病毒脱除率。结果表明,3种热处理方式均能100.0%脱除红颜茎尖组培苗中的SMYEV。综合组培苗存活率和病毒脱除率,确定起始温度32℃,按1℃·d^(-1)升至38℃后培养30 d是最适宜的SMYEV脱除方式。

草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位预测

抗原表位是抗体识别并结合抗原的部位。抗原表位的预测有助于重组抗原的设计、快速筛选和高活性抗原的快速制备。通过DNAStar、Ex PASy、TMHMM Sever2.0和IEDB等软件对草莓轻型黄边病毒的外壳蛋白的二级结构、理化及生物学性质进行了分析。分析结果显示,草莓轻型黄边病毒的外壳蛋白中不存在跨膜区域;平均亲水性为-0.252,属于可溶性蛋白;潜在的抗原表位有5个,平均抗原指数为0.026 5~0.077 3。预测的上述5个抗原表位是否有抗原活性及其活性强弱仍有待于相应的试验论证。

北京地区不同品种草莓种苗中草莓轻型黄边病毒的检测与分析

以产自北京地区的36个品种的草莓种苗为试材,采用田间调查和RT-PCR方法,研究草莓轻型黄边病毒(SMYEV)在不同品种草莓种苗上的影响,以期为草莓品种选育和推广工作提供参考依据。结果表明:采集的431株草莓种苗中检出SMYEV阳性样品30份,病毒检出率为6.96%。其中,8个品种的草莓种苗中检出SMYEV,检出率为6.5%~23.1%,而其他28个品种均未检出。通过基因克隆、序列测定和比对分析,获得3个北京分离物的SMYEV外壳蛋白(CP)核苷酸序列,北京分离物BJHY253与美国草莓分离物WSU1988CP基因序列的同源性为98.63%;北京分离物BJHYZ83与阿根廷草莓分离物Berra-2CP基因序列的同源性为99.04%,北京分离物BJLYN与中国福建草莓分离物FJ2 CP基因序列的同源性为98.63%。通过对不同草莓品种中的SMYEV进行检测分析和序列测定,发现SMYEV在不同品种草莓种苗中的检出率存在差异,北京地区草莓种苗中SMYEV序列具有多样性,属于不同的株系,这些结果可以为草莓的田间生产和病毒防控提供数据支持。

草莓组培苗的病毒检测与其果实品质分析

以2种不同大小的草莓茎尖分生组织为试材,进行组织培养,分别获得再生小植株并进行病毒检测,利用上述脱毒母株和农家自留种苗分别繁育匍匐茎子苗,研究了2种子苗的病毒发生率与果实品质,以期通过草莓脱毒试验为脱毒苗的应用推广提供参考依据。结果表明:不同草莓品种的病毒含量有差异,并且病毒外壳蛋白表达量与其核酸转录量一致。切取草莓匍匐茎约5 mm茎尖分生组织进行第一次脱毒,其部分再生小植株仍然携带了低浓度病毒。与之相比,再切取试管苗约0.5 mm茎尖组织进行第二次脱毒,其再生率虽然仅为31%,但是二次脱毒株均为无毒苗。利用已鉴定的脱毒母株和农家自留种苗分别繁育匍匐茎子苗,经过定植后发现2种子苗的病毒病发生率差异极显著。二次脱毒母株繁育的子苗果实可滴定酸含量显著低于农家自留种苗(P<0.05),而可溶性总糖等品质参数差异不显著。综上所述,以0.5 mm茎尖分生组织为外植体进行草莓组织培养,可以获得优质的脱毒母株,相关研究成果有助于未来草莓良繁体系建设。

草莓轻型黄边病毒CP蛋白的原核表达及抗血清制备

利用PCR技术扩增草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)中国分离物的外壳蛋白(coat protein, CP)基因,将SMYEV CP基因克隆至原核表达载体pET-32a,重组质粒pET-cp转化大肠杆菌BL21菌株,37℃振荡培养,1 mmol·L^(-1)IPTG诱导表达,检测发现CP融合蛋白大量存在于细胞裂解上清液中。Ni^(2+)-NTA亲和树脂纯化CP融合蛋白,Western blot可检测到较单一的特异性条带,分子量约为46 kDa。用纯化的CP融合蛋白免疫家兔获得多抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价达1∶512 000。以此多抗血清建立了Dot-ELISA和胶体金试纸条检测方法,不仅可以检测感染SMYEV的草莓样本,用于感病草莓的早期诊断和鉴定,还可以用于SMYEV CP蛋白的瞬时表达和系统表达等分析。

草莓轻型黄边病毒3＇末端序列多态性研究

The 930 bp segment in 3’ terminal region of Strawberry mild yellow edge virus(SMYEV)genome was amplified by 3’ rapid amplification of cDNA ends(RACE).Ten Chinese isolates were sequenced,and 7 of them were the same.Nucleotide and amino acid identities and phylogenesis were analyzed between Chinese isolates and 24 isolates from other regions of the world.Sequence analysis of the 878 nt stretch within 3’ terminal region of SMYEV genome showed that nucleotide acid identities ranged from 79.5% to 100%,deduced amino acid sequences of coat protein gene identity were 86.4% to 100%.Phylogenetic analysis showed that all isolates of SMYEV fell into four clades.To a certain extent,the clades were related with the geological distribution of SMYEV.Chinese isolates SY01 and SY04 lay in the same clade with European and American isolates,but formed a small separate branch.Isolates SY03 and SY02,derived from Fragaria×ananassa cv.Changhong-2 and F.pentaphylla respectively,had a far relationship with other isolates and fell into one clade.They were likely to be the special isolates that existed only in China.

陕西省草莓病毒种类的LncRNA测序初步鉴定

为明确陕西省草莓主要病毒种类及各种病毒在主产区的地理分布,通过LncRNA测序结合反转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)对陕西省草莓主产区西安、咸阳和宝鸡的7个区或县的草莓疑似感染病毒病样品进行了检测。结果表明草莓斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)和草莓镶脉病毒(strawberry vein band virus,SVBV)在7个区或县均有发生,而草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)、菠菜潜隐病毒(spinach latent virus,SpLV)和番茄线虫传多面体病毒(Lycopersicon esculentum nepovirus,LENV)局部发生。首次报道在草莓上检测到Sp LV和LENV。