紫云英SSR分子标记的开发及在品种鉴别中的应用

利用生物素标记的(AG)15、(CT)15、(AC)15、(GT)15探针及链霉素亲和磁珠,从紫云英的基因组中富集微卫星(SSR)序列。在用富集片段构建插入文库的950个转化子中,经PCR检测及测序共得到127个SSR序列,微卫星序列的富集效率达15.8%。除去重复或无效的序列,得到33个序列用于引物设计。对征集的9个紫云英品种进行多态性分析,有6对引物扩增出明显且稳定的多态性位点18个。在紫云英的品种水平上,这些SSR位点产生的多态率为50%～100%,有效等位基因数为1.19～1.64,Nei氏遗传多样性为0.13～0.38,Shannon多态信息指数为0.22～0.56;利用这6对引物可将参试品种完全区分开,证明这些SSR位点可用于紫云英品种的指纹鉴别。根据SSR位点的相似性系数,将9个紫云英品种主要聚成两个类群,与传统按生育期的紫云英品种划分结果无必然的联系。

ISSR-PCR和链亲和素磁珠吸附法开发白菜SSR引物

分别利用ISSR-PCR和链亲和素磁珠吸附法分离白菜基因组微卫星,共得到41对SSR引物。ISSR-PCR法运用巢式PCR,分别设计微卫星两侧引物IP2和IP3,SSR引物得率为12%。磁珠吸附法首先利用生物素标记的SSR探针与文库杂交,链亲和素磁珠吸附富集含SSR的片段。然后用接头引物扩增,克隆。根据测序结果,设计SSR两侧引物PL和PR,引物得率为9.6%。

利用生物信息学数据及工具合成表达链霉亲和素基因

目的:人工合成表达链霉亲和素基因,制备链霉亲和素磁珠复合物用于核酸分离。方法:利用NCB I、BCM等提供的生物信息及软件工具,将链霉亲和素蛋白的基因进行密码子优化,并分割成互为重叠的小片段寡聚核苷酸链,采用化学和酶促合成相结合的方法合成编码链霉亲和素蛋白基因。将纯化的链霉亲和素通过偶联剂与带羧基的磁粒共价结合,用于快速纯化生物素化的DNA。结果:用化学与酶促相结合一步法合成链霉亲和素全基因序列,用较短寡聚核苷酸链及较低的引物浓度合成该基因突变率很低,链霉亲和素在大肠杆菌中得到高效表达。用硅酸包衣的磁性微球对磁场反应良好且无磁记忆性,用碳二亚胺可实现活性羧基磁性微球与链霉亲和素两者的交联,反应条件温和。结论:制备的链霉亲和素磁珠复合物可用于生物素化的PCR产物纯化。

玉叶金花(Mussaenda pubescens)SSR引物的快速开发

利用链亲和素磁珠吸附法捕捉能与生物素标记的探针(AC)15退火结合的玉叶金花(Mussaenda pu-bescens)微卫星序列的单链限制性酶切片段.获得的单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEMT载体上,转化至DH5α中,得到一个微卫星序列文库.经测序统计,引物得率为12.5%;根据序列设计的SSR两侧引物PL和PR,共得到5对有多态性的SSR引物.玉叶金花微卫星引物的筛选将为下一步进行玉叶金花基因组结构的分析、分子进化和系统发育研究提供重要的微卫星标记.

基于磁珠的可见光检测微阵列信号的新方法

以磁珠作为标记物,提出了一种在微阵列上检测核酸的新方法。该法基于生物素同链霉亲和素的亲和作用,利用磁珠的超顺磁性和宏观可见特性,使得杂交结果可在普通的光学显微镜或放大镜下检测,甚至肉眼可见。以合成探针为对照,用参比荧光标记染料Cy3标记方法,对这种新方法的检出限进行了研究,并在此基础上采用大肠杆菌16s rDNA的PCR产物作为样品,进行了细菌检测的尝试,取得了较好的实验结果。本法所得的实验结果易于观测,无需采用大型的荧光检测仪器,因而大大降低了检测成本,与其它可见光检测方法(如金胶银染等)相比,具有方便、快捷的特点。这种新方法在传染病检测和环境监测中将具有广阔的应用前景。

三角帆蚌微卫星位点筛选及多态性分析

采用磁珠富集法,以生物素标记的(CA)10寡核苷酸为探针,构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)基因组微卫星富集文库。根据微卫星位点的侧翼序列设计引物,随机挑选扩增出与预期大小相符的32对引物,引物荧光标记后对24个三角帆蚌个体分别进行PCR扩增,共筛选出20对多态性较好的引物。结果表明,20个微卫星位点的等位基因数为5～20,有效等位基因数2.321 3～13.260 3。观察杂合度和期望杂合度分别为0.318 2～1.000 0和0.582 5～0.946 1;PIC值0.547 2～0.919 9;其中14个位点符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。本研究筛选的20个微卫星标记可作为三角帆蚌遗传多样性、种群遗传结构等研究的理想分子标记。

用SSR分子标记分析无融合生殖龙须草的遗传多样性

采用磁珠富集法构建龙须草微卫星文库,并开发出27对具有多态性的SSR引物,利用其中具有扩增差异的8对稳定的SSR引物,对龙须草11个居群和71个单株进行聚类分析。结果表明：居群间共检测到123个等位基因,每对引物可以稳定检测到6~34个多态性片段。居群间的遗传相似系数为0.70~0.97,聚类分析将11个居群划分为4个类群,表明龙须草大多数居群之间的分化程度较低,与无融合生殖的特性相吻合。采用UPGMA法将分散在龙须草11个居群的71个单株分为3个群,与以居群为单位的研究结果相近;但是,星子居群内的3个单株、洋县居群的1个单株分别与本居群亲缘关系较远并与其他居群亲缘关系较近,显示在这2个居群内不同单株间存在较大的遗传差异,这种差异可能是居群内单株间无融合生殖程度不同所致。因此,在这2个居群内可能存在有性生殖频度较高的单株。

SA-hIL-21修饰磁珠的合成及其生物学功能的研究

过继性免疫效应细胞疗法是一种安全、疗效较好的肿瘤免疫疗法,而体外扩增免疫细胞是过继性免疫效应细胞疗法的一个重要环节.为了探索一种高效的促进人外周血淋巴细胞增殖的方法,我们通过发酵罐工艺生产SA-hIL-21融合蛋白,随后通过DEAE SFF阴离子交换层析柱分离纯化和柱上复性该蛋白,再将SA-hIL-21融合蛋白锚定到磁珠上,最后比较hIL-21蛋白标准品、游离SA-hIL-21融合蛋白、SA-hIL-21融合蛋白修饰磁珠促进人外周血淋巴细胞增殖的效率.本实验成功获得了高锚定率的SA-hIL-21修饰磁珠,并发现其促进人外周血淋巴细胞增殖明显优于hIL-21蛋白标准品,为后续体外大规模培养外周血中某种或多种免疫细胞奠定了基础.

巴氏蘑菇微卫星序列的分离及其对Co^60辐射诱变菌株的鉴别

根据链霉素磁珠和生物素特异结合的特性,用生物素标记的二聚核苷酸重复序列探针从巴氏蘑菇的基因组中分离微卫星序列。将结合于链霉素磁珠上的标记探针同两端连接已知序列人工接头的巴氏蘑菇DNA酶切片段杂交。洗脱未杂交DNA片段后,用磁珠富集的片段建立微卫星文库。挑取522个菌落用对应重复序列为引物进行PCR筛选,得到48个阳性克隆,经测序有32个菌落含微卫星序列。微卫星富集效率为阳性克隆数的67%,总克隆数的6%。除去重复或无效的微卫星序列,在设计出的12对用于鉴别85个巴氏蘑菇的Co60辐射变异株微卫星引物中,有4对引物总共扩增出明显的变异菌株17个。证明有些微卫星位点可用于巴氏蘑菇辐射变异品种的指纹筛选与鉴别。

用生物素标记探针和链亲和素磁珠分离HLA-A、-B、-C位点单体型

目的建立生物素标记探针和链亲和素磁珠分离人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）-A、-B、-C单体型的技术，以解决HLA分型过程中部分模棱两可的结果。方法根据IMGT／HLA数据库中HLA等位基因的序列信息，设计5’端生物素标记探针。将探针与104份标本基因组DNA混合杂交，然后加入链亲和素磁珠孵育，形成链亲和素磁珠一生物素探针一单链DNA复合物，通过洗涤和解析从而实施有效的分离。对分离出的单体型基因组DNA进行HLA-A、-B或-C位点扩增和测序分析。结果设计的12个HLA-A、19个HLA-B、13个HLA-C位点探针中，经测序证实分别有9个、9个、5个探针成功分离了单链DNA标本。结论建立的探针和磁珠分离HLAA、-B、-C单体型技术具有可行性，可以解决HLA测序分型中部分模棱两可结果，提高分型的准确性。

低拷贝病毒RNA捕获及多重实时荧光定量PCR检测

目的:为提高COVID-19检测灵敏度,减少新冠患者临床假阴性检测结果,本研究建立了一种SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA捕获方法。方法:利用链霉亲和素磁珠,设计并合成生物素探针捕获SARS-CoV-2假病毒RNA;对磁珠用量、生物素探针浓度和洗脱次数等捕获条件进行了优化;参考WHO发布的序列,针对SARS-CoV-2病毒基因组的ORF1ab基因和N基因序列合成引物和TaqMan探针,对捕获的SARS-CoV-2假病毒RNA进行反转录实时荧光定量PCR检测。采用一步法和分步法检测、单重和多重实时荧光定量PCR检测,并分别比较检测结果。结果:本研究设计的生物素探针能富集到距离探针结合位点至少1.8 K处的序列,在生物素探针浓度12.5μM,磁珠的工作浓度333.33μg/mL时,合并RNA的两次洗脱液,对低拷贝病毒RNA的捕获效率最高。研究得到对低拷贝病毒RNA分步法比一步法、多重比单重实时荧光定量PCR检测更灵敏,进行分步法、多重实时荧光定量PCR检测限低于10 copies/μL,组间和重复实验组之间CT值变异系数均小于1%。所有阴性对照样品在检测中均为阴性。结论:本研究优化的链霉亲和素磁珠-生物素探针捕获法是富集SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA的有效方法,其抽提RNA病毒的结果优于一些商业化试剂盒,分步法、多重实时荧光定量PCR对SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA实现了高效检测,这为临床检测低拷贝RNA病毒提供了一种参考方案。