SCX-SPE结合UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS分析草乌中的四类二萜生物碱

目的对草乌中的二萜生物碱进行表征分析。方法以强酸性阳离子交换树脂固相萃取(SCX-SPE)分离纯化草乌中的二萜生物碱,并结合超高效液相色谱串联四极杆静电场轨道阱质谱(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)进行结构鉴定。结果结合精确分子质量、多级质谱裂解规律、对照品对比、Clog P值及文献报道,共从草乌中鉴定了99个二萜生物碱类成分,包括双酯型二萜生物碱(DDA)27个,单酯型二萜生物碱(MDA)29个,酰胺型二萜生物碱(ADA)40个,多酯型二萜生物碱(PDA)2个,以及长链型二萜生物碱(LDA)1个。结论本文所建立的SCX-SPE结合UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法能快速地鉴定草乌中的二萜生物碱类成分,可为草乌的药效物质基础及质量控制研究提供科学依据。

蔬菜中灭蝇胺残留的强阳离子交换固相萃取柱净化-液相色谱分析

建立了简单、快速测定蔬菜中灭蝇胺残留量的方法。蔬菜样品经乙酸胺-乙腈（1∶4,体积比）混合溶液提取,强阳离子交换固相萃取（SCX-SPE）柱净化后,采用高效液相色谱仪在波长215nm处测定,所用色谱柱为Agilent NH2,流动相为乙腈-水溶液（97∶3,体积比）,以1.0mL/min的流速等梯度洗脱。结果表明,在浓度为0.02～2mg/L范围内,线性相关系数为0.999 9。灭蝇胺的添加浓度在0.05～0.4mg/kg范围内,平均回收率为83.4%～104%,相对标准偏差为1.7%～8.4%,均在农药残留测定所允许的范围内。该方法的最低检出限（LOD）为0.02mg/kg,最低检测浓度（LOQ）为0.05mg/kg。

基于强阳离子交换色谱分离的磷酸化肽段富集策略

为了在短时间内获得相对含量高的磷酸化肽段,以标准磷酸化蛋白质为模型对强阳离子交换色谱(SCX)分离磷酸化肽段体系的缓冲溶液和梯度设置进行了研究,并用酵母酶切肽段混合物考察了该路线在较复杂的样品中的应用。实验结果表明优化后的体系能够在30min内分离出磷酸肽段,而且非磷酸化肽段的干扰很少,这样便相对提高了磷酸化肽段在质谱仪中的响应强度,重要的是该体系可以对复杂样品进行很好的分离。这说明SCX用于规模化磷酸化肽段富集的策略是可行的。本研究为磷酸化蛋白质组学规模化分析提供了实用技术。

强阳离子交换色谱分离多肽混合物的条件优化

以酵母全蛋白提取液的胰蛋白酶切产物为研究对象,对多维色谱分离中常用的强阳离子交换色谱的分离条件,包括上样量、盐的种类、调节缓冲液pH值的酸的种类及有机溶剂的比例进行了考察和比较。结果表明,在强阳离子交换色谱分离线性上样量范围内,在氯化铵溶液作为流动相,用磷酸调节流动相缓冲液pH值至2.7,且流动相中乙腈的体积分数为30%条件下进行梯度洗脱时,可获得最佳的分离结果。本结果可为采用二维色谱-质谱策略分析多肽混合物时的第一维强阳离子交换色谱分离条件的选择提供有益的参考。

一种混合模式反相强阳离子交换色谱固定相的制备及其保留机理的考察

采用一种简单的"混合配体"方法将辛基和磺酸基键合到硅胶表面,制备了辛基-磺酸基共同键合硅胶(OSS)材料。通过元素分析和吸附容量检测对OSS材料进行表征,证明辛基和磺酸基已成功键合到硅胶表面上。将该OSS硅胶材料作为混合模式反相强阳离子交换(RP/SCX)色谱固定相,在反相液相色谱(RPLC)流动相条件下,采用几种碱性探针分子定量地考察了该固定相的混合模式RP/SCX保留机理。通过改变流动相中缓冲盐的浓度,考察了溶质保留因子和盐浓度的对数和倒数的关系,得到了几种碱性探针分子在该混合模式OSS固定相上的单点和两点保留机理的数学模型。对两种数学模型的方程进行了线性拟合,结果表明两点保留机理更加符合实验的结果。此外,根据混合模式两点保留机理的数学方程,可以得到单一的疏水或离子交换作用力对总保留的影响,对混合模式色谱的实际分离应用可提供有价值的参考。

气相色谱-氮化学发光检测法测定烟草中的苦参碱及消解动态研究

建立了简单、快速的鲜烟叶中苦参碱的测定方法。样品用0.01 mol/L的乙酸水溶液(pH3.5)提取,强阳离子交换柱(SCX-SPE)净化,气相色谱-氮化学发光检测器(GC-NCD)测定。通过净化方法比较发现,SCX-SPE法比常规溶剂萃取法具有更好的净化效果。在选定的色谱条件下,苦参碱在0.15～15.0μg/mL范围内,其质量浓度与峰面积之间呈良好的线性关系,决定系数R2=0.999 7。对烟草空白样品进行添加回收试验,在0.05～0.4 mg/kg范围内其回收率在89.5%～91.6%之间,相对标准偏差(RSD)在2.7%～3.6%之间,检测限(LOD)为0.03 mg/kg,能满足苦参碱在烟草样品中的残留检测。田间试验结果表明:苦参碱的消解动态曲线符合一级动力学方程,其在烟草中的半衰期为7.64 d,属易降解农药。

稻米中13种苯氧羧酸类除草剂多残留的高效液相色谱-质谱测定

建立了高效液相色谱-质谱联用（HPLC—MS）选择离子监测（SIM）同时测定稻米中13种苯氧羧酸类除草剂多残留的方法。样品经过乙腈提取，盐酸酸化，SCX阳离子交换吸附剂分散固相萃取净化后，采用HPLC—MS测定。对13种苯氧羧酸类除草剂的液相色谱分离、样品前处理条件进行了详细的研究和优化，13种苯氧羧酸类除草剂在0．02～1．0mg／L范围内线性良好，相关系数为0．9954～0．9998。在0．05～1．0mg／kg范围内，平均添加回收率为77％～99％，相对标准偏差为0．9％～14．9％。

强阳离子交换色谱法从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白的研究

本实验研究了离子交换色谱技术大规模纯化乳铁蛋白的色谱条件。选用的SP Sepharose Fast Flow离子交换剂对乳铁蛋白有很好的吸附选择性,洗脱速度可达到2L/h。以pH值为7.7～8.0,10mmol/L的磷酸盐为起始缓冲液,通过改变离子强度进行分步洗脱。先采用0.5mol/L的NaCl溶液选择性洗脱分泌型免疫球蛋白A和乳过氧化物酶组分,再采用1mol/L的NaCl洗脱LF组分。经SDS-PAGE测定,所得乳铁蛋白组分显示为单一区带,相对分子质量为80400Da。经等点聚焦测定,所得乳铁蛋白的等电点为8.65。中试生产的精制品中乳铁蛋白的纯度和回收率分别为94.20%和75.45%。

新型强阳离子交换在线净化固相萃取整体柱与液相色谱串联质谱联用测定猪肉中的克伦特罗

以甲基丙烯磺酸钠(SMAS)为单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂,在内径为4.6mm的不锈钢柱管中聚合得到一种新型强阳离子交换在线净化整体柱。扫描电镜图显示该整体柱结构均匀、连续、多孔。将其用作萃取介质,结合高效液相色谱-串联质谱检测猪肉中残留的克伦特罗。结果表明,该整体柱能够有效地对猪肉中的克伦特罗富集净化,方法的线性范围为0.05～10.0μg/L,相关系数(r)为0.9988,定量下限为0.5μg/kg,完全满足我国对该类药物残留的限量要求。方法在0.5、1.0、5.0μg/kg 3个加标水平下的平均回收率分别为91%、94%、96%,相对标准偏差分别为4.9%、4.5%、3.4%。该在线净化液相色谱串联质谱法简单、高效、准确,可用于日常检测。

无孔单分散亲水性强阳离子交换固定相的制备及其在蛋白质快速分离中的应用研究

采用分散聚合法制备小颗粒种子及“一步种子溶胀聚合”法成功地制备了粒径为3.0μm的无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂,其表面经水解、环氧化、再水解后与氯磺酸反应,制备了一种新型的强阳离子交换色谱填料(SCX)。详细考察了该填料对标准蛋白质的分离性能及流动相中盐的种类、有机溶剂、流速等对蛋白质保留的影响。实验结果表明,在流速为4m L/m in时,采用线性梯度洗脱,1.0m in内可快速分离4种标准蛋白质,蛋白质的保留符合阳离子交换色谱规律。将SCX应用于快速纯化鸡蛋清中的溶菌酶和猪心中的细胞色素-C,取得了较好的效果。

硅基高交联磺化PS-DVB离子交换剂的研究

采用活化硅小球与双乙烯基封头剂反应制得乙烯基硅烷键合相,在过氧化苯甲酰诱发下,乙烯基硅烷键合相进一步与苯乙烯(PS)以及二乙烯基苯(DVB)混合单体共聚制得硅基PS-DVB,该硅基PS-DVB共聚物在冰水浴中用氯磺酸磺化制得一种硅基高交联磺化PS-DVB离子交换剂。用红外光谱表征磺化前后及经强碱处理过的离子交换剂,结果发现苯环特征吸收峰的相对强度无明显降低,表明该硅基离子交换剂具有很好的耐酸碱稳定性。用该离子交换剂分离碱性化合物,获得了较好的分离效果。

强阳离子交换毛细管液相色谱-反相加压毛细管电色谱二维系统的构建及其在中药黄柏提取物分离中的应用

加压毛细管电色谱(pCEC)具有电泳和液相色谱的双重分离机理,其柱效高、选择性强、分辨率高和分离速度快并可进行梯度洗脱。我们在此基础上加入离子交换色谱模式,构建了强阳离子交换-反相加压毛细管液相色谱(micro strong cation exchange liquid chromatography/reversed phase pressurized capillary electrochromatogra-phy,μ-SCXLC/RP-pCEC)二维系统,并对中药黄柏的提取物进行了优化分离。第一维μ-SCXLC采用线性盐梯度分离,样品被切割成11个馏分洗脱收集后进入第二维,第二维脱盐后,采用RP-pCEC进行分离分析,梯度洗脱。以中药黄柏提取物为样品,此二维系统的分辨率和峰容量都较一维系统有很大提高,理论峰容量可达900左右,证明构建的二维体系非常适合复杂样品的分离分析。

人源LL-37杀菌多肽的改建及原核细胞中表达

目的改良人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列,提高其杀菌力,并在原核细菌中表达。方法应用蛋白质分析软件(Anthepro5.0、SWISS-MODEL等),对人源杀菌肽LL-37的氨基酸序列进行二维、三维结构及理化特性分析,将其中部分氨基酸残基进行替换,提高其正电荷,并以人源杀菌肽LL-37的基因序列为模板,进行相应的DNA序列替换,转入表达载体pET-28a(+)于杆菌BL21(DE3)中表达、纯化,并初步研究其抗菌性。结果在维持LL-37空间构象不变的基础上,将Glu16、Asp26、Glu36分别替换为Gln16、Asn26、Gln36,其静电荷由pH7.4时的+5.8提高到+9.0,并且其多肽N端疏水、C端亲水的特性不变。通过Touch-Down PCR法,成功获得改良LL-37多肽的DNA序列,并将重组质粒pET-28a(+)-rLL-37在杆菌BL21(DE3)中表达,改良LL-37多肽成功由强离子交换柱芯Macro-Prep High S纯化,并对G+、G-菌具有一定的抗菌力。结论将杀菌肽LL-37多肽进行氨基酸残基替换并以原核细胞进行融合型表达是可行的,为改良LL-37的大量制备及杀菌活性研究奠定了基础。

分离蛋白质的高效强阳离子交换色谱填料的合成及性能研究

带端羟基的大孔硅胶与氯磺酸反应制得分离蛋白质的强阳离子交换色谱填料。填料分离度高，蛋白质活性回收率大于７６％，可用于蛋白质及生物工程产品的分离。

凝胶过滤/离子交换全二维液相色谱系统的构建与评价

基于蛋白质的尺寸及带电性质,将凝胶过滤色谱(GFC)与离子交换色谱(IEC)两种分离模式结合,采用双捕集柱接口构建了GFC/2×IEC二维液相色谱(2-D LC)分离系统,同时考虑离子交换色谱分离蛋白质对等电点范围的限制,进一步结合中心切割平行柱的方法实现对蛋白质的全二维分离。为与后续蛋白质在线酶解、多肽分离及质谱鉴定匹配,系统中采用常规柱以保证蛋白质质谱鉴定对样品量的要求,3种常规分离柱分别选用凝胶过滤色谱柱TSK-GEL G3000SW_(XL)(300 mm×7.8 mm,5μm)、强阴离子交换色谱柱Hypersil SAX(100 mm×4.6 mm,10μm)和强阳离子交换色谱柱Hypersil SCX(100 mm×4.6 mm,10μm)。最终以酵母细胞蛋白质提取液为样品,对构建的二维系统加以评价,在总蛋白质浓度13.5 mg/mL、上样体积100μL的条件下,将第一维分离等时间切割17次,并将切割馏分全部导入第二维继续分离,二维系统在148 min内获得的总峰容量达到884。说明所构建的系统可以用于蛋白质的在线全二维分离。

强阳离子交换树脂在蛋白质分离纯化中的应用

为了进一步考察流动相中盐种类、体积流量及有机溶剂等对蛋白质保留的影响,采用新的化学方法将3.0μm无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂改性为一种新型的强阳离子交换色谱填料;实验分析了该填料对标准蛋白的分离性能,有机溶剂、流动相盐种类和体积流量等对蛋白质保留的影响.实验结果表明:当体积流量为3mL/min时,在1.5min线性梯度时间内可快速分离四种标准蛋白质,且蛋白质的保留符合阳离子交换色谱规律.该填料的动力学吸附容量为7.13mg/mL,将其应用于快速纯化鸡蛋清中的溶菌酶和猪心中细胞色素-C,可取得较好的效果.

磺化修饰结合离子交换色谱和生物质谱富集鉴定含组氨酸肽段

通过在肽段的N端引入磺酸基,从而使含组氨酸的肽段与其他肽段在pH<3.0的条件下产生电荷差异,建立了一种基于强阳离子交换色谱(SCX)结合生物质谱富集鉴定含组氨酸肽段的方法,并以含有组氨酸的标准蛋白质为模型,进行了方法学考察。结果表明,经N端磺酸化后,含组氨酸的肽段能有效地被阳离子交换色谱富集,且在肽的N端引入磺酸基促进了肽的裂解,使之产生简单而信息丰富的二级质谱图,从而得到完美的质谱鉴定结果。这说明磺化修饰结合强阳离子交换色谱用于含组氨酸肽段的富集鉴定是可行的,且具有在蛋白质组研究中应用的潜力。

基于比色法快速测定尿液中色氨酸的含量

L-色氨酸表达异常与多种疾病相关,我们建立一种方法检测尿液中色氨酸含量。首先通过SCX强阳离子交换剂对尿液进行前处理,回收率为78.2%,再利用埃利希氏反应对尿液色氨酸进行检测,采用紫外-可见分光光度计测定595nm处吸收值,在0-200μM范围内呈线性,线性相关系数达到0.9928。本研究实现了尿液中色氨酸的简单、快速、可视化检测。

液相色谱法快速测定乳制品中三聚氰胺含量

建立高效液相色谱法快速测定乳制品中三聚氰胺的分析方法。采用三氯乙酸溶液-乙腈提取乳制品中的三聚氰胺,用强阳离子交换色谱柱(SCX,250 mm×4.6 mm,5μm),在流动相配比为0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH=3.0)-乙腈(65+35,体积比)条件下分离,紫外检测器210 mm波长检测。结果表明:采用外标法定量,该方法在0.10 mg/L～10.0 mg/L浓度范围内有良好的线性关系,加标回收率均在91%以上,相关系数R2为0.999 9,相对标准偏差不大于1.2%,方法最低检出限为0.01 mg/L。通过实验室间能力验证证明,该方法具有快速、准确、灵敏度高,样品前处理简便易行等优点,可满足实验室日常快速检测乳制品中三聚氰胺的工作需求。

高效液相色谱分离牛胸腺多肽的研究

本文以不同色谱方法对牛胸腺多肽进行了分离,寻求出能对牛胸腺多肽得到满意分离的色谱条件。