稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

hTERT基因表达在肝细胞肝癌发生发展中的作用及意义

目的 研究端粒酶催化亚单位 (h TERT)基因表达在肝细胞肝癌 (HCC)发生发展中的作用及意义。方法 应用免疫组化 (SP法 )和半定量逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)同步检测 6 2例 HCC及其对应癌旁组织、8例正常肝组织中 h TERT及 h TERTm RNA的表达情况 ,分析 h TERT基因表达与 HCC临床病理参数的关系。结果 h TERT蛋白主要定位于肝癌细胞胞浆内 ,偶见核内染色。h TERT和 h TERTm RNA在 HCC中的阳性率分别为 88.71%、82 .2 6 % ,分别明显高于癌旁肝组织的阳性率 9.6 8%、6 .4 5 % ,差异具有非常显著性 (P <0 .0 1)。 h TERT及其 m RNA在 8例正常肝组织均未见表达。统计学分析显示 ,HCC中的 h TERT基因表达与肿瘤分期分级、门静脉有无癌栓、血清中甲胎蛋白表达水平、是否合并 HBV感染等有关 (P <0 .0 5 )。结论 h TERT基因可能在 HCC的发生发展中起着重要作用 ,其表达有望成为 HCC的重要分子生物学指标。

人端粒酶催化亚单位基因单核苷酸多态性与胃癌的关系

目的探讨人端粒酶催化亚单位基因（human telomerase catalytic subunit，hTERT）Ex2-659A／G位点单核苷酸多态性与胃癌患者发病风险的关系。方法对甘肃西部三家医院外科手术切除168例胃癌患者（病例组）和同期在上述医院查体的健康人群156例（对照组）进行病例对照研究；采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性技术（PCR—RFLP）对2组进行基因型分析，比较各基因型分布频率和发病风险的关系。结果病例组hTERT Ex2-659A／G位点AA、AG、GG基因型的频率与对照组相比无显著差异。病例组A、G等位基因频率分别为44．74％和55．26％，对照组为43．42％和56．58％，2组A、G等位基因型频率比较有显著性差异（χ^2=5．3734，P=0．0204）。与G／G基因型相比，A／G和A／A2种基因型的个体患胃癌的危险度（OR）分别为0．519（95％CI：0．310—0．870，P=0．013）、0．550（95％CI：0．255～1．188，P=0．128）。结论hTERT Ex2-659A／G单核苷酸多态性可能为胃癌的保护因素。

细胞因子诱导人脐血间充质干细胞分化过程中细胞巢蛋白、神经丝亚单位和端粒酶逆转录酶mRNA的表达

目的:观察细胞因子EGF和bFGF联合诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化过程中细胞 巢蛋白(nestin)、神经丝亚单位M(NF M)和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的变化。方法:采集健康自然分娩产 妇脐血,密度梯度离心分离单个核细胞(MNCs),PBS洗涤2次后重悬于含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12 中,接种于T 75培养瓶内(细胞密度为1×106ml-1),一组加入细胞因子EGF和bFGF,终浓度各为10μg/L,另一 组不加细胞因子,剩余细胞用液氮冻存。培养24h倾去全部液体以除去未贴壁细胞,以后每3d全量换液1次,倒 置显微镜下观察细胞形态。分别收集培养1d、4d、7d、14d贴壁细胞和冻存细胞,采用RT -PCR方法检测nestin、 NF M、hTERTmRNA的表达。结果:未培养的脐血MNCs(内含MSCs)nestin、NF M、hTERTmRNA均表达阳性。培 养后nestin、hTERTmRNA表达下降,至第7d已不能检出;而NF MmRNA的表达随培养时间延长而增强。与对照 组相比,细胞因子组NF MmRNA表达较高,nestin、hTERTmRNA表达的下降趋势延迟。结论:细胞因子EGF和 bFGF在联合诱导脐血MSCs分化为神经细胞的过程中,能下调hTERTmRNA的表达。

不同程度宫颈病变组织中端粒酶催化亚单位的表达与临床病理特征的关系

目的:探讨端粒酶催化亚单位(hTERT)在不同程度宫颈病变组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:收集不同程度宫颈病变石蜡组织标本共236例,其中宫颈炎41例、CINⅠ级45例、CINⅡ级42例、CINⅢ级41例、宫颈鳞状细胞癌39例、腺癌28例。采用免疫组化SP法检测不同程度宫颈病变组织中hTERT蛋白表达,并将结果与患者临床病理特征结合分析,探讨hTERT表达与临床病理特征的关系。结果:在宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈鳞状细胞癌、腺癌组织中hTERT表达阳性率分别为0.00%(0/41)、2.22%(1/45)、7.14%(3/42)、39.02%(16/41)、92.31%(36/39)、92.86%(26/28),组间比较差异有统计学意义(P<0.05),CINⅠ与CINⅡ之间hTERT表达阳性率不存在统计学差异(P>0.05),而CINⅠ与CINⅢ、CINⅡ与CINⅢ之间hTERT表达阳性率存在统计学差异(P<0.05);鳞癌、腺癌组中高、中、低分化三组间hTERT表达阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。hTERT蛋白的表达与高危型HPV感染、宫颈肿瘤家族史呈正相关(P<0.05),但与年龄、性生活开始年龄、性伴侣人数、人工流产次数、吸烟、避孕方法选择等高危因素无相关性(P>0.05)。结论:hTERT表达的检测有可能成为宫颈病变发展及宫颈癌的诊断及鉴别诊断的一种新指标,但不一定参与肿瘤分化和生物学特性。