去SUMO化酶SENP5的表达、纯化、活性测定及复合物重组

SENP5参与转录调控、蛋白质稳态、DNA修复和细胞分裂等重要生命过程,与癌症、发育缺陷和神经变性等疾病密切相关.SENP5包含N端的无规则卷曲和C端的催化结构域.研究对SENP5的催化结构域(SENP5CD)进行了表达和纯化.C末端水解活性实验表明SENP5CD对SUMO2前体(pSUMO2)的切割活性大于SUMO1前体(pSUMO1).分子筛实验证明,SENP5能够与SUMO1和SUMO2的前体、RanGap1-SUMO1和RanGap1-SUMO2形成稳定的复合物.实验构建了SUMO1-PA和SUMO2-PA活性探针,这2种活性探针都能与SENP5CD反应形成共价结合的复合物.通过比较AlphaFold预测的SENP5CD-pSUMO1和SENP5CD-pSUMO2复合物结构,发现pSUMO2与SENP5CD的结合比pSUMO1更紧密.研究表达、纯化了SENP5,鉴定了酶活性,获得了SENP5CD与底物的复合物,为进一步研究SENP5奠定了基础.

染色质阅读器蛋白EBS和SHL的诱导表达和体外SUMO化修饰鉴定

EBS和SHL是植物特有的一类染色质阅读器蛋白,通过特异性识别并结合两类功能相互拮抗的组蛋白修饰调控靶基因表达和相关生物学过程,但目前未见有关翻译后修饰调控其蛋白功能的报道。利用大肠杆菌SUMO化修饰重建体系发现,EBS和SHL都存在SUMO化修饰,且不论以哪种SUMO分子亚型为供体都只有一条SUMO化条带,根据SUMO化条带和与本底蛋白分子量差值推测均为单位点的单SUMO化修饰。进一步利用定点突变实验证实,K216是EBS唯一且关键的SUMO化位点,而SHL的SUMO化位点有待继续研究,但至少可以排除K111、K178和K220三个位点,为下一步探讨SUMO化修饰调控EBS和SHL的蛋白功能奠定了基础。

SUMO化修饰对NF-κB信号通路的调控

小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)经由一系列酶介导的生化级联反应共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上,稳定靶蛋白免受降解的过程称为SUMO化修饰(SUMOylation)。核转录因子κB(nuclear factors κB,NF-κB)是公认的炎症和免疫反应的重要调节因子,并与糖尿病的发生发展密切相关。近年来研究发现,不仅NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)的SUMO化修饰参与NF-κB信号通路的调节,而且SUMO酶可以直接调节NF-κB对靶基因的转录。现就SUMO亚型及结构,SUMO化修饰与去SUMO化修饰过程,SUMO、SUMO酶对NF-κB的转录调控及其与糖尿病相关性的最新研究进展作以综述。

蛋白质多聚SUMO化修饰及其功能

泛素(ubiquitin,Ub)是一类高度保守的小蛋白,可与靶蛋白的赖氨酸残基共价连接,形成多聚泛素链行使功能.类似于泛素化修饰过程,小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)也可以共价修饰靶蛋白的赖氨酸残基,从而影响靶蛋白的定位、稳定性以及蛋白间的相互作用,发挥重要的生理功能.尽管在多数情况下,靶蛋白发生的是单SUMO化修饰,但最近研究发现,SUMO依赖自身的赖氨酸也可以形成多聚链.与单SUMO化修饰不同的是,多聚SUMO化修饰的靶蛋白可以进一步被泛素化修饰,进而诱导靶蛋白的降解.这是一种新的、特殊的化学修饰形式,弄清它的生理功能,对于了解细胞的生长、分化以及凋亡等生理过程将具有重要的意义.本文将就此方面的最新研究进展做一综述.

UBC9介导SUMO化修饰在同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡中的作用研究

目的探讨泛素结合酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9,UBC9)介导SUMO化修饰在同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡中的作用。方法首先采用细胞计数试剂(cell counting kit-8,CCK-8)法和Western blot检测不同浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L和200μmol/L)同型半胱氨酸对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的活力及焦亡的影响;采用Western blot检测不同组细胞中UBC9、SUMO化修饰蛋白SUMO-1、炎症因子IL-1β的表达水平;qRT-PCR检测干扰前后UBC9的mRNA表达,同时检测干扰UBC9后,UBC9、焦亡相关蛋白、IL-1β及SUMO-1相关表达。结果当采用100μmol/L的Hcy刺激后,巨噬细胞的活力影响最小且焦亡蛋白NLRP3、Caspase-1表达最明显(P<0.001);与Control组相比,Hcy组IL-1β的表达水平升高(P<0.01),SUMO-1表达升高(P<0.01);与Control组相比,Hcy组中UBC9蛋白水平及mRNA水平表达均增高(P<0.05);转染si-UBC9后,与si-NC+Hcy组相比,si-UBC9+Hcy组NLRP3、Caspase-1、IL-1β、UBC9、SUMO-1表达降低(P<0.01)。结论同型半胱氨酸诱导巨噬细胞焦亡的发生,其机制与上调泛素结合酶9发生SUMO化修饰有关。

2型糖尿病患者血清SUMO1水平与高甘油三酯血症相关性研究

目的·探究2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者血清小泛素样修饰分子1(small ubiquitin-like modifier-1,SUMO1)水平与高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)之间的相关性。方法·选取2020年9月至2021年3月在上海交通大学医学院附属新华医院内分泌科门诊就诊的新诊断为2型糖尿病的患者共239例,其中T2DM合并HTG组患者92例,T2DM不合并HTG组患者147例。收集患者基本信息和实验室指标,分析2组患者血清SUMO1水平的差异。采用二元Logistic回归分析T2DM合并HTG的影响因素,采用多元线性逐步回归分析血清SUMO1水平对T2DM合并HTG风险的影响。结果·与T2DM不合并HTG的患者相比,T2DM合并HTG患者的血清SUMO1水平明显升高(1114.99 pg/mL vs 902.43 pg/mL,P<0.001)。二元Logistic回归分析提示血清SUMO1水平(OR=1.527,95%CI 1.200~1.943)、糖化血红蛋白(OR=1.202,95%CI 1.038~1.391)、血尿酸(OR=1.006,95%CI 1.003~1.010)是T2DM合并HTG的独立危险因素。将血清SUMO1水平按照四分位分层,校正各种混杂因素后,以Q1层作为对照,Q4层T2DM合并HTG的风险是Q1层的2.707倍(95%CI 1.231~5.951)。多元线性逐步回归分析发现女性、腰臀比、甘油三酯、血肌酐是血清SUMO1水平升高的独立危险因素。结论·T2DM合并HTG患者血清SUMO1水平显著高于不合并HTG患者,血清SUMO1水平是T2DM合并HTG的独立危险因素。

细粒棘球蚴感染诱导巨噬细胞Sp3的SUMO化修饰

目的探究Sp3的SUMO化修饰在细粒棘球蚴感染的巨噬细胞中的作用。方法体内随机分为对照组(PBS)与实验组(肝被膜下接种原头节悬液),免疫组化检测小鼠肝脏SUMO1、UBC9表达;免疫荧光双染检测巨噬细胞CD206和SUMO1荧光共定位。体外RAW264.7巨噬细胞分为对照组、LPS组、LPS+EgCF组,12 h收集细胞qRTPCR检测SUMO1、UBC9、IL-6、IL-10 mRNA表达;免疫印迹法检测SUMO1、UBC9的蛋白水平;COIP检测SUMO1与Sp3的互作。结果体内实验:与对照组比,实验组包囊近端肝脏组织炎性区细胞高表达SUMO1、UBC9蛋白,CD206+巨噬细胞与SUMO1共定位。体外实验:EgCF刺激RAW264.7细胞炎症模型促进IL-10表达,抑制IL-6表达,诱导SUMO1、UBC9 mRNA、蛋白表达,诱导Sp3的SUMO化。结论细粒棘球蚴感染诱导巨噬细胞Sp3的SUMO化修饰。

SENP1在SPOP去SUMO化修饰中的作用研究

目的:研究小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰对SPOP(speckle type BTB/POZ protein)蛋白水平和细胞定位的影响,并尝试在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)中探讨SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific proteases 1,SENP1)和SPOP之间的相关性。方法:利用野生型(wild type,WT)和Senp1敲除的小鼠胚胎成纤维细胞研究Senp1对Spop蛋白水平和细胞定位的影响,并通过比较外源WT-Spop和Spop的SUMO修饰位点突变体的蛋白表达量,进一步确认SUMO修饰对Spop蛋白水平的影响。后续通过邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)研究WT-Spop及其SUMO修饰位点突变体与SUMO1的结合能力。最后通过ccRCC患者的RNA表达数据和ccRCC细胞系探讨SENP1和SPOP在ccRCC中的相关性。结果:Senp1敲除下调小鼠胚胎成纤维细胞中Spop的蛋白量和稳定性,但不影响其细胞核定位。突变Spop的SUMO修饰位点后,其与Sumo1的结合能力下降,蛋白量也有所降低。SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关。结论:Senp1通过去SUMO化修饰稳定Spop蛋白,SENP1和SPOP的表达在ccRCC中呈正相关。

CtBP1 SUMO化修饰的分子机制研究

目的在体外重组表达、纯化CtBP1发生SUMO化修饰时参与反应的各个蛋白:CtBP1(底物)、SUMO1(SUMO蛋白)、Ubc9(E2结合酶)和PC2(E3连接酶),体外组装CtBP1 SUMO化修饰复合体CtBP1-SUMO1-Ubc9-PC2,通过结构解析捕捉CtBP1发生SUMO化修饰的中间状态,阐明CtBP1 SUMO化修饰的分子机制。方法通过pRSFDuet-1载体构建人源CtBP1、SUMO1、Ubc9、PC2表达质粒,系统表达纯化各蛋白组分,并通过分子筛检测并优化各个蛋白的状态,以及CtBP1-SUMO1-Ubc9-PC2复合体的形成,通过单颗粒冷冻电镜解析复合体结构。结果通过原核表达系统成功表达并纯化获得了参与CtBP1 SUMO化反应复合体中的各个蛋白CtBP1、SUMO1、Ubc9与PC2,获得了CtBP1 SUMO化修饰复合体,通过负染和冷冻电镜的样品优化初步获得了CtBP1 SUMO化修饰复合体的冷冻电镜结构。结论成功获得了CtBP1 SUMO化反应中间状态CtBP1-SUMO1-Ubc9-PC2复合体蛋白以及初步的冷冻电镜结构,为阐明CtBP1发生SUMO化修饰的分子机制奠定了重要基础。

SUMO化修饰精细调控内皮HEY1在血管生成中的作用

HEY1(hairy/enhancer of split related with YRPW motif 1)是在内皮生成中发挥重要作用的一种经典转录抑制因子,但HEY1的具体作用机制尚不清楚。SUMO化修饰(SUMOylation)是一种翻译后修饰过程,在血管发育和组织动态调节可能具有潜在作用。首先,作者通过免疫沉淀实验发现,K82R、K292R、K90R赖氨酸残基的缺失会抑制HEY1的SUMO化修饰,对应的三重突变体HEY1-3KR几乎没有SUMO化修饰。

利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究

利用pSUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达若干种外源蛋白,如鼠源成纤维细胞生长因子(FGF)-21、人源FGF-21、人源白细胞介素(IL)-1β,并与pET-30a(+)及pTYB11表达系统作比较。将鼠源FGF-21、人源FGF-21及人源IL-1β基因分别亚克隆至pSUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。上述基因在pET-30a(+)及pTYB11中表达量极低,考马斯亮蓝染色几乎检测不到。在pSUMO表达体系中这些基因均以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效的切割,获得纯度较高的成熟蛋白。上述蛋白可在pSUMO表达系统中获得高效可溶性表达。

基于SUMO软件的公路作业区行车风险仿真分析

文章基于SUMO仿真软件,参照《公路养护安全作业规程》(JTG H30—2015)关于作业区各个区域长度的设定要求,在SUMO中构建仿真环境。试验工况为:封闭右侧单车道。结合实际工况,交通量和大车比例均分为三种情况,采用TTC和DRAC作为评价指标。实验结果表明,在任意工况和任意交通量条件下,车辆进入上游过渡区所形成的“TTC风险墙”、“DRAC风险墙”位置均随着大车比例的上升而提前,其相应厚度也同时增加。

蛋白质SUMO化修饰研究进展

SUMO(small ubiquitin-related modifier)是类泛素蛋白家族的重要成员之一,可与多种蛋白结合发挥相应的功能,其分子结构及SUMO化反应途径都与泛素类似,但二者功能完全不同。SUMO化修饰可参与转录调节、核转运、维持基因组完整性及信号转导等多种细胞内活动,是一种重要的多功能的蛋白质翻译后修饰方式。SUMO化修饰功能的失调可能导致某些疾病的发生。

SUMO融合系统高效表达可溶性鼠源FGF-21及其活性的研究

利用SUMO表达载体在大肠杆菌中高效可溶性表达鼠源成纤维细胞生长因子(FGF-21)成熟蛋白,并研究其调节血糖的功能。将鼠源FGF-21成熟蛋白基因亚克隆至SUMO表达载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白,透析后利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得纯度较高的成熟蛋白。将3T3-L1成纤维细胞分化成脂肪细胞,经微量化的GOD-POD法检测培养基中葡萄糖含量,统计学分析葡萄糖消耗率。结果表明,在SUMO表达体系中鼠源FGF-21成熟蛋白基因以可溶形式表达,且可被SUMO蛋白酶I有效地切割,获得纯度较高的成熟蛋白。与未经处理的脂肪细胞对照组相比,经鼠源FGF-21成熟蛋白处理后脂肪细胞对葡萄糖的摄取利用显著增加,残存在培养基中的葡萄糖含量明显减少;两样本比较的t检验,P<0.001,差异极显著。

小泛素相关修饰物SUMO研究进展

蛋白质翻译后修饰对改变蛋白功能、活性或定位都起着非常重要的作用,泛素及其相似蛋白的修饰是其中一种重要形式。与其他诸如磷酸化、乙酰化、糖基化等不同的是,泛素及其相似蛋白的修饰基团本身即是一个小的多肽,通过异肽键与靶蛋白Lys侧链e-NH2相连,其中小泛素相关修饰物(smallubiquitin-related modifier,SUMO)与蛋白的共价连接是一种新的广泛存在的翻译后修饰形式。SUMO是广泛存在于真核生物中高度保守的蛋白家族,在脊椎动物中有三个SUMO基因,称为SUMO-1,-2,-3,与泛素在二级结构上极其相似,且催化修饰过程的酶体系也具有很高的同源性。然而,与泛素化介导的蛋白酶降解途径不同,SUMO化修饰发挥着更为广泛的功能,如核质转运、细胞周期调控、信号转导、转录活性调控等。

sumo化及sumo化修饰酶对糖尿病肾病NF-κB信号通路的调控

核转录因子(nuclear factorκb,NF-κB)是公认的炎症和免疫反应的调节因子,与糖尿病肾病的发生发展密切相关。小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,sumo)参与了NF-κB信号通路的调控,NF-κB抑制蛋白(inhibitor ofnf-κB,IκB)等NF-κB通路中重要的蛋白因子均可被小泛素相关修饰物修饰,进而调控NF-κB信号通路。sumo化修饰酶在该调控中发挥极其重要的作用,其中sumo结合酶E2(即ubc9蛋白)和sumo连接酶E3成员之一的信号转导和转录激活子(signal transducer and activator of transcription,STAT)抑制蛋白(protein inhibitor of activated STAT,PIAS)家族是近年来的研究热点。文中综述sumo化、sumo化修饰酶及其对糖尿病肾病NF-κb信号通路的调控作用。

一种新型SUMO E3连接酶CBX4的化学修饰作用

多梳蛋白家族(polycomb group proteins,Pc G)是一类在染色质水平上通过表观遗传修饰抑制靶基因转录的调节因子,它在调节细胞周期、DNA修复、细胞分化、衰老和死亡中起到重要作用。CBX4作为Pc G家族中唯一具有SUMO E3连接酶活性的成员,可以作用于多种底物,包括HIPK2、SIP1、Ct BP、CTCF、Dnmt3a和HIF-1α等。底物的SUMO化修饰依赖于特定的结构基础,而且SUMO化的底物功能也会相应发生改变。同时,CBX4还可以被其它分子,如HIPK2,SENP2等进行磷酸化以及去SUMO化等修饰。本篇综述详细阐述了CBX4对底物的SUMO化修饰、自身被修饰及其生物学功能的变化。

SUMO-2/3与孕激素受体的共价结合及其对该受体转录活性的调节

目的研究B型孕激素受体(progesterone receptor B type;PRB)是否能被SUMO-2、SUMO-3类泛素化修饰,并探讨这种修饰对孕激素受体转录活性的影响。方法以人的MCF-7 cDNA为模板进行PCR反应,扩增出SUMO-2、SUMO-3的cDNA,构建真核表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;将质粒pXJ40-myc-PRB分别与pcDNA3-FLAG、pcDNA3FLAG-SUMO2、pcDNA3FLAG-SUMO3共转染人胚肾细胞293T,运用免疫共沉淀及western印迹的方法检测其是否发生类泛素化修饰;运用测定荧光素酶报告基因的方法检测类泛素化修饰对孕激素受体转录活性的影响。结果构建成功表达载体pcDNA3FLAG-SUMO2与pcDNA3FLAG-SUMO3;免疫共沉淀实验证实sumo2/3均可以与PRB共价结合;SUMO-2、SUMO-3能以孕激素依赖的方式增强PRB的转录活性。结论 SUMO-2、SUMO-3分子能够对孕激素受体PRB进行类泛素化修饰,并调节其分子功能。

SUMO特异性蛋白酶家族的结构、分布、功能和调控

蛋白质的翻译后修饰对调节蛋白质的功能活性和定位以及调控细胞周期进程和细胞分化都起着非常重要的作用,其中小泛素样修饰蛋白(SUMO)化修饰是一个可以由SUMO特异性蛋白酶(SENPs)家族逆转的高度动态的过程。SENPs能够从与SUMO连接的靶蛋白上催化去除SUMO,以及从它的前体蛋白上裂解SUMO;同时,此家族部分成员还参与SUMO的成熟活化过程;因此,去SUMO化修饰对于调节SUMO连接蛋白的功能及活性与SUMO化同样重要。本文就SENPs家族的结构及生物学特性作一综述。

SUMO化:一种重要的体内翻译后蛋白质修饰系统(英文)

靶蛋白被小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰已经成为真核细胞特有的翻译后蛋白质修饰标志之一。SUMO与靶蛋白之间这种可逆的共价连接,在核质运输、DNA 与蛋白质结合活性、蛋白质之间相互作用、转录调控、DNA 修复以及维持基因组稳定等方面均发挥着重要的调节作用。在许多人类疾病如癌症和神经退化性疾病中,SUMO化修饰作用对疾病的发生与发展起着极为重要的作用。阐明 SUMO 化修饰在这些疾病中的功能,将为疾病的治疗开辟一条崭新的思路。