基于酵母产孢的syntaxin家族蛋白SNARE区域功能分析

真核细胞中大部分膜融合过程由SNARE蛋白介导,但其功能和调节机制尚未完全清楚。酵母孢子形成是研究囊泡融合机制包括SNARE蛋白的理想模型系统。在该过程中涉及t-SNARE蛋白Sso1,它是突触囊泡融合所需蛋白syntaxin 1A的同源物,两者SNARE区域有51%的同源性。尽管如此,将SSO1的SNARE区域完全替换成syntaxin 1A,而构建的嵌合体却无法回补sso1△突变的产孢缺陷。为了确定哪些残基为Sso1功能所必须,作者进行了嵌合体和突变分析,发现Sso1/syntaxin 1A嵌合体中syntaxin 1A的SNARE区域的220位丙氨酸换成谷氨酸后获得产孢功能。另外,Sso1发生相应的突变-218位谷氨酸突变成丙氨酸后失去其功能。因此,218位谷氨酸残基为Sso1产孢功能所必须。

热休克蛋白70调节突触融合蛋白Syntaxin 1在哮喘中的表达

目的探讨热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)对突触融合蛋白Syntaxin1(SYX1)在哮喘大鼠肺组织中表达水平的调节及相互作用。方法 30只健康Wistar大鼠按随机原则分为对照组、哮喘组、哮喘+地塞米松组,每组10只。通过卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏、激发建立哮喘大鼠模型,采用免疫组织化学、逆转录PCR及蛋白免疫印迹检测3组间HSP70及SYX1基因和蛋白表达水平,免疫共沉淀技术检测HSP70与SYX1的相互关系。结果与对照组比较,哮喘组HSP70及SYX1基因和蛋白表达水平均增加,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05);与哮喘组比较,哮喘组+地塞米松组HSP70及SYX1基因与蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05),但与正常对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05,P>0.05)。免疫共沉淀结果显示在哮喘大鼠肺组织中HSP70与SYX1存在相互作用。结论 HSP70及SYX1在哮喘肺组织中表达水平均明显增高,HSP70通过调节SYX1表达水平及相互作用共同参与哮喘的发病机制,且其表达受地塞米松的抑制,为临床寻找药物干预新的靶点提供了理论依据。

人SNARE复合物相关蛋白的表达与纯化

[目的]构建人SNARE复合物中的SNAP25、Syntaxin 1a和VAMP1蛋白真核表达载体,并于体外进行表达纯化。[方法]将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒;用脂质体转化法,将重组杆粒转染至Sf9昆虫细胞中使其产生重组病毒,最后对病毒进行扩增后再感染Sf9昆虫细胞表达目的蛋白;所得蛋白进行Western Blot鉴定及纯化。[结果]测序结果表明SNAP25、Syntaxin 1a和VAMP1真核表达载体构建成功,Western Blot检测出三种蛋白的特异性条带,利用His标签蛋白纯化出Syntaxin 1a蛋白。[结论]利用杆状病毒表达系统成功表达出了SNARE复合物相关蛋白。

补益脾胃元气方药对SAMP8小鼠海马突触活性带蛋白cplx1/2及stx1表达的影响

目的:观察补益脾胃元气方药对SAMP8小鼠空间学习记忆能力、突触功能相关蛋白complexin1/2(cplx1/2)、syntaxin1(stx1)表达的影响,探讨此类方药防治老年性痴呆的作用机制。方法:将3月龄SAMP8小鼠随机分为模型组、盐酸多奈哌齐组、补益脾胃元气方药组(人参汤组、洗心汤组、大补元煎组),另以3月龄SAMR1小鼠作为空白对照组,连续灌胃给药10周后进行相关指标检测。采用Morris水迷宫实验观察各组小鼠空间学习记忆能力。免疫组化和Western blot检测小鼠海马区cplx1/2、stx1表达。结果:与模型组比较,治疗组逃避潜伏期显著缩短(P<0.01),穿台次数显著增加(P<0.05),目的象限活动时间显著延长(P<0.01)。免疫组化和Western blot结果表明,补益脾胃元气方药各组小鼠海马cplx1/2、stx1表达较模型组显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论:补益脾胃元气方药可明显改善SAMP8小鼠空间学习记忆能力,其机制可能与影响小鼠海马突触功能相关蛋白的表达有关。