Tachyplesin-I对胃腺癌BGC-823细胞膜作用的质量浓度阈值

目的探讨抗菌肽tachyplesin-I对胃腺癌BGC-823细胞膜的作用机制。方法 BGC-823细胞用不同质量浓度tachy-plesin-I处理,再用台盼蓝拒染法测定活细胞率,荧光分光光度计检测细胞膜荧光素渗漏,激光共聚焦显微镜和电镜观察细胞膜的破坏情况。结果低质量浓度(≤25mg/L)tachyplesin-I对细胞存活没有明显影响,细胞膜荧光素渗漏较少[(15.14±0.05)～(17.84±0.68)];高质量浓度tachyplesin-I(≥50mg/L)使细胞存活率明显下降,细胞膜荧光素渗漏较多[(60.54±4.08)～(67.57±0.18)],并进一步引起细胞死亡。结论 tachyplesin-I对BGC-823细胞膜存在质量浓度阈值,低质量浓度tachyplesin-I引起膜可逆性通透,高质量浓度tachyplesin-I造成细胞膜严重损伤。

中国鲎鲎素T-1抗人早幼粒白血病HL-60细胞活性研究

利用从中国鲎血细胞中提取的鲎素Ｔ－１作抗肿瘤活性实验．结果表明，鲎素Ｔ－１在体外对人早幼粒白血病ＨＬ－６０细胞的增殖有明显抑制作用．急性毒理实验显示，鲎素Ｔ－１对正常活体毒性较小，可用于活体实验．荷瘤裸鼠实验统计，鲎素Ｔ－１对肿瘤抑制率达４２．３％．

鲎素I对普通变形杆菌的作用研究

旨在研究鲎素Ⅰ对普通变形杆菌的抑杀作用机制。利用鲎素Ⅰ对普通变形杆菌的抑杀浓度、壁膜通透性和电荷性、分泌蛋白酶活力的影响及其在培养基中的稳定性进行研究。结果显示,鲎素Ⅰ对普通变形杆菌的MIC和MBC值分别为40-80和80μg/mL,它也能增加普通变形杆菌的壁膜通透性及其所带的正电荷。在鲎素Ⅰ浓度≤40μg/mL时,普通变形杆菌分泌的蛋白酶活力有所增加,而≥60μg/mL时,则呈下降趋势。在普通变形杆菌培养环境中的鲎素Ⅰ含量会降低。结果证明,鲎素Ⅰ能对普通变形杆菌产生抑杀作用,其抑菌机制与破坏细菌壁膜的通透性有关。

鲎源抗菌肽对大肠杆菌基因组DNA和RNA作用的分子机制

为了探讨鲎素对细菌基因组DNA和RNA作用的分子机制,采用琼脂糖凝胶阻滞电泳、荧光和紫外光谱的方法研究了鲎素对细菌基因组DNA和RNA的影响,结果表明鲎素能够与大肠杆菌基因组DNA发生作用,并呈浓度依赖关系,浓度越高对细菌基因组DNA损伤越大;鲎素也能与基因组DNA和RNA结合,抑制其迁移。鲎素与基因组DNA的结合方式有待进一步研究,此结果为在分子水平上深入了解鲎素的杀菌机制提供重要的理论依据。

抗菌肽(tachyplesin Ⅰ)串联基因的构建、表达及抗菌活性

为了实现通过基因工程方法制备具有稳定结构的抗菌肽tachyplesinⅠ,采取了tachyplesinⅠ基因串联表达的方法。实验以高拷贝穿梭表达载体pSBPTQ为表达载体,通过RT-PCR扩增tachyplesinⅠ基因(tac)和采用直接退火的方法合成tachyplesinⅠ串联基因(2tac)。构建重组表达载体pSBPTQ-TAC和pSBPTQ-2TAC,转化到枯草杆菌WB800实现高效表达,经2%蔗糖诱导获得表达串联产物(2TAC)和TAC。通过离子交换柱层析纯化后得表达产物2TAC和TAC,2TAC经BrCN水解后,对表达产物抑菌活性分析,观察发酵液上清对大肠杆菌(E.coli K88)和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的抑菌圈和细胞微观形态的变化。实验结果表明:基因tac和2tac在枯草杆菌中表达成功,表达产物在发酵上清液中的含量分别约为8.25、17.36 mg L 1;表达产物TAC和2TAC对大肠杆菌K88和伤寒沙门氏菌都具有明显的抑菌作用,2TA C经BrCN水解产物抑菌活力高于TAC。

毕赤酵母工程菌株表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白发酵条件的优化

能分泌表达重组人溶菌酶-鲎素融合蛋白的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌(X33/pPICZαA-human lysozyme-TachyplesinⅠ构建的)。除了基因本身内在特性外,表达条件对外源基因的表达量也有着极显著的影响。本文在摇瓶水平上通过发酵液起始pH、甲醇诱导浓度、诱导时间这3个因素进行表达条件优化。通过生长曲线,Bradford检测以及平板扩散试验分析,获得摇瓶发酵表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白的最佳条件为发酵液初始pH 5.0,甲醇诱导浓度为2.0%,诱导时间为72 h;Bradford检测法分析显示表达量最高,平板扩散试验显示融合蛋白对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)抑菌能力最明显,为进一步大规模发酵表达人溶菌酶-鲎素融合蛋白奠定了基础。

紫外线诱导大肠杆菌产生对鲎素抗药性菌株的研究

探讨经过紫外线诱变能否筛选出抗鲎素的大肠杆菌突变菌株以及突变菌株对抗生素敏感性的变化.以大肠杆菌JM109和ATCC25922为研究对象,通过紫外线诱变技术对出发菌株进行诱变,以相应的出发菌株作对照,并通过鲎素浓度梯度平板法对大肠杆菌进行初筛后,对初筛到的抗鲎素菌株进行亚抑菌浓度鲎素的连续传代诱导和抗生素对初筛到的抗鲎素菌株进行敏感性测定.结果表明,采用紫外诱变和鲎素浓度梯度筛选的方法,从中筛选到低抗鲎素的大肠杆菌ATCC25922 3株;通过抗生素对此3种低抗鲎素菌株进行敏感性测定,表明抗鲎素菌株对苄星青霉素有显著抗药性,而对盐酸左氧氟沙星仍然敏感.对于大肠杆菌JM109菌株,经过紫外线诱变后,未诱导出抗鲎素菌株.

鲎素对嗜水气单胞菌的抑菌活性及作用机制研究

为探讨鲎素对嗜水气单胞菌的抑杀作用,采用最小抑菌浓度、AB染料、扫描电镜、流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳等方法研究鲎素对嗜水气单胞菌的抗菌活性、杀菌率、胞内紫外物质泄露、膜负电荷数、外部形态结构及胞内基因组DNA的影响。结果表明,鲎素对嗜水气单胞菌的抗菌活性较其他细菌弱;2倍最低杀菌浓度(MBC)鲎素能在短时间内迅速杀死嗜水气单胞菌并导致胞内生物大分子泄漏;扫描电镜发现1倍MBC鲎素能导致轻微的壁膜破损及一些胞内物质渗出和粘连;流式细胞仪结果表明,1倍MBC鲎素能破坏细胞膜的完整性;AB染料测定表明鲎素处理后能改变膜负电荷数;琼脂糖凝胶电泳表明,鲎素能够与嗜水气单胞菌的基因组DNA发生作用,并呈浓度依赖关系,浓度越高对细菌基因组DNA损伤越大。鲎素对嗜水气单胞菌的抑菌活性弱,只有高浓度时才能短时间内导致胞内紫外吸收物质泄露、膜负电荷数发生改变及基因组DNA损伤。

坛紫菜转鲎素基因的初步研究

以坛紫菜为材料,利用电穿孔法将构建的含有鲎素基因tachyplesinI的同源重组表达载体pSV40-HR-MAR-tachyplesinI导入坛紫菜叶状体体细胞.并通过PCR、Southern杂交等分子生物学检测方法对导入后的细胞进行检测,结果表明构建的以坛紫菜18S rDNA的460、1200bp的序列作为外源基因3′端和5′端同源重组序列,同时以家蚕的MARs序列作为增强表达序列的同源重组表达载体导入坛紫菜叶状体体细胞后,鲎素基因tachyplesinI能整合到坛紫菜叶状体体细胞内.通过Northern点杂交检测的结果表明,鲎素基因能在坛紫菜体细胞内瞬时表达.本研究构建的鲎素基因同源重组表达载体可用于相关大型海藻的转基因研究中.

鲎源抗菌肽对大肠杆菌的抑杀机理

【目的】研究鲎源抗菌肽鲎素对大肠杆菌抑杀的作用机理,为防治大肠杆菌引起的肠道疾病提供新的潜在抗菌药物。【方法】利用牛津杯法和微量MH肉汤稀释法测定其抗菌活性,激光共聚焦扫描显微镜观察鲎素对大肠杆菌的结合、分布及杀伤过程,透射电镜观察鲎素对大肠杆菌超微结构的影响,并采用琼脂糖凝胶阻滞电泳研究其对大肠杆菌基因组DNA和RNA的影响。【结果】鲎素对大肠杆菌的最小抑菌浓度与最低杀菌浓度分别为5 mg/L和20 mg/L;激光共聚焦扫描显微镜和透射电镜观察发现鲎素能快速作用于细胞表面,并发生聚集现象,随着作用时间的延长能导致细胞膜结构的破坏和细胞内含物的释放;通过琼脂糖电泳结果显示鲎素也能够作用于大肠杆菌基因组DNA,并呈浓度依赖关系,10 mg/L鲎素对基因组DNA无明显影响,80 mg/L鲎素能导致DNA断裂;凝胶阻滞电泳显示鲎素也能与基因组DNA和RNA发生结合。【结论】研究结果为深入探讨鲎素抑杀大肠杆菌的分子机制提供重要的理论依据。

基因工程鲎素对金黄色葡萄球菌小鼠感染模型治疗效果

基因工程鲎素体外抑菌活性良好,为进一步评价其在体内抑菌活性和治疗效果,本研究建立了金黄色葡萄球菌小鼠肺部和腹腔感染模型,探讨了基因工程鲎素对2种感染模型小鼠的治疗效果。比较基因工程鲎素治疗前后,不同模型小鼠的存活率、血液以及组织中的细菌载量变化;比较治疗前后小鼠肺部感染动物模型的病理学变化。结果表明,与对照组相比,基因工程鲎素治疗后肺部感染模型小鼠存活率升高40%,腹腔感染模型小鼠存活率升高60%,治疗后腹腔感染小鼠血液中的细菌载量下降10~4倍;病理学分析结果表明,基因工程鲎素治疗后小鼠肺脏的炎症反应较轻,肺部组织结构被破坏程度较轻。综上所述基因工程鲎素对金黄色葡萄球菌感染小鼠的体内治疗效果明显,显著提高了小鼠存活率,抑制了细菌的扩散,减轻了病理炎症变化,初步表明基因工程鲎素具有良好的抗感染药物研发前景。

绿脓杆菌对鲎素耐受性特点及耐受性机制的研究

【目的】为了探讨鲎素作为抗菌药物在临床使用中的安全性问题,通过鲎素连续增高浓度法对绿脓杆菌进行耐受性诱导,并对其耐受性机制进行初步研究,以期为鲎素的广泛应用提供理论依据。【方法】绿脓杆菌ATCC27853为试验菌株,通过连续增高浓度诱导法筛选抗药菌株,并通过抗药稳定性、交叉抗药性、抗药性代偿测定来探究其耐受性特点,通过对其胞外蛋白酶活性、生物膜形成、胞外多糖含量的变化来探讨其抗药性机制。【结果】通过连续增高鲎素浓度法对原始菌株进行30多代诱导后,绿脓杆菌ATCC27853对鲎素的MIC值逐渐增高,80多代时产生了明显抗药性。抗药菌株对丁胺卡那以及pexiganan、鲎素同源肽tachyplesin III、polyphemusin I均能产生不同程度的抗药性。在无药培养基中抗药菌株以更长的延滞期作为抗药性代偿,但在有药培养基中具有更短的延滞期和更大的生长速率。抗药菌株较原始菌株分泌的胞外蛋白酶活性增高,并能降低鲎素的抗菌活性。在同样条件下抗药菌株较原始菌株胞外多糖含量增高,更易形成生物膜。【结论】在长期选择压力下绿脓杆菌ATCC27853对鲎素能产生抗药性,其抗药性机制可能与生物膜形成、胞外蛋白酶失活鲎素有关。关于细菌对鲎素的抗药性机制,有待进一步研究。

基因工程鲎素对小鼠非特异性免疫的影响及作用机制

抗菌肽具有抗感染和介导宿主天然免疫防御作用,是理想的抗生素替代物,实验室前期用研发的基因工程鲎素(TPI)对小鼠金黄色葡萄球菌感染模型开展的治疗效果显示,小鼠感染模型肺部及其他脏器中菌含量明显减少,肺部的病理变化减轻,治疗效果较好。本试验在此基础上,从宿主天然免疫防御的角度开展了TPI对小鼠非特异免疫功能的影响及机制研究。用滴鼻的方式给小鼠使用TPI,测定不同剂量TPI对小鼠体征指标,包括:体质量、肺廓清指数、脾脏指数的影响。用腹腔注射的方式给小鼠使用TPI,测定非特异性免疫相关指标,包括:小鼠单核细胞和巨噬细胞的吞噬能力、小鼠β-防御素2(mBD-2)和小鼠胸腺肽β4的表达水平,结果显示与对照组相比,TPI可提高小鼠增重,可显著提高小鼠的巨噬细胞吞噬能力及廓清指数;可上调小鼠脏器中mBD-2和小鼠胸腺肽β4的表达水平,增强宿主防御能力,激活机体非特异性免疫,提示TPI不但能直接杀伤病原体,还能够激活和协同宿主防御肽共同发挥非特异免疫作用。