Correlation of serum ASPH and 5'-NT contents with angiogenesis and cancer cell proliferation in patients with liver cancer

Objective:To proliferation in patients with liver cancer.Methods: Patients with primary liver cancer who underwent surgical resection in Yulin Third Hospital between December 2013 and December 2016 were selected as the liver cancer group of the research, and healthy volunteers who received physical examination in Yulin Third Hospital over the same period were selected as the control group of the research. Serum was collected from both groups to test the contents of ASPH and 5'-NT as well as liver cancer cell proliferation molecules;liver cancer lesions and para-carcinoma lesions were collected from liver cancer group to detect the contents of angiogenesis molecules and cancer cell proliferation molecules.Results: Serum ASPH and 5'-NT contents in liver cancer group were significantly higher than those in control group;VEGF, VEGFR1, VEGFR2, HGF, EGFR, Bcl-2, Bcl-x and Bcl-w contents in liver cancer lesions were significantly higher than those in para-carcinoma lesions and positively correlated with serum ASPH and 5'-NT contents in patients with liver cancer while Bax and Bak contents in liver cancer lesions were significantly lower than those in para-carcinoma lesions and negatively correlated with serum ASPH and 5'-NT contents in patients with liver cancer;serum AFP, GP73, GPC3 and DKK1 contents in liver cancer group were significantly higher than those in control group and positively correlated with serum ASPH and 5'-NT contents in patients with liver cancer.Conclusion: Serum ASPH and 5'-NT contents increase significantly in patients with liver cancer and can accurately evaluate angiogenesis and cancer cell proliferation.

大肠杆菌组合生物合成紫杉烯的研究

目的在大肠杆菌中建立一个能够生物合成紫杉烯(紫杉醇生物合成的第一个重要中间体)的代谢途径。方法利用PCR方法克隆编码大肠杆菌1-脱氧-5-磷酸木酮糖(D-1-deoxyxylulose 5-phosphate,DXP)合酶和异戊烯二磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IDI)的基因,以及编码辣椒(Capsicum annuum)牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,GGDP) 合酶的基因。分别构建含DXP合酶基因的表达载体pSLB208/DXP和含GGDP合酶与IDI异构酶基因的融合表达载体pAIG。将含紫杉烯合酶的表达载体pETB3和本研究构建的这2个表达栽体共转化大肠杆菌,诱导4个基因在大肠杆菌中共表达;并通过GC-MS分析大肠杆菌工程菌的代谢产物。结果在大肠杆菌中构建了一个合成紫杉烯的途径,通过GC-MS分析检测到紫杉烯的合成。结论利用代谢途径工程合成紫杉醇中间体是可行的,可为其他萜类化合物中间体代谢工程研究提供坚实的物质基础。

紫杉二烯合酶基因在灵芝中的表达

【目的】论文旨在研究紫杉二烯合酶基因(ts)在灵芝中的表达情况,为利用灵芝作为生物反应器表达紫杉醇及其中间产物提供科学理论依据。【方法】制备灵芝菌株的原生质体:把培养好的灵芝菌丝用0.6 mol·L-1的甘露醇溶液洗涤两次后,加入1%溶壁酶溶液,30℃水浴酶解3 h,离心去上清液得到纯的灵芝原生质体,用0.6mol·L-1的甘露醇溶液把原生质体的浓度调整到108个/mL备用;外源基因(ts)的转化:在含有灵芝原生质体的缓冲液各加入含有ts基因和潮霉素抗性基因hph的真核表达载体pgGIgpd-TS和pBgGI-hph 1.0μg,冰浴30 min;加入0.5 mL PEG buffer,在室温下放置20 min;将离心收集的原生质体涂布在不含有潮霉素的再生平板上,25℃培养5—7 d后,待长出白色菌落后,往平板表层覆盖一层含有潮霉素的PDA半固体培养基,于25℃培养;转化子的鉴定:以灵芝的菌丝基因组DNA和RNA为模板,进行PCR和RT-PCR扩增,鉴定ts基因在灵芝中的表达情况;目标产物的检测:对提取的产物采用不分流进样的方式进行气相质谱联用(GC-MS)检测,进样温度250℃,初始温度100℃,保留1 min,每分钟升高8℃,加热到300℃,保留2 min。【结果】经潮霉素初步筛选后,在含有潮霉素抗性的平板上长出白色的菌落,灵芝原种作为阴性对照的平板上没有长出菌落,说明潮霉素基因被成功转入了灵芝并得到了初步的表达;PCR鉴定结果表明20个拟转化子中有4个转化子同时整合了ts基因和hph基因,两个基因的共转化率为20%;RT-PCR鉴定结果表明,4个灵芝转化子实现了外源ts基因的转录;提取转ts基因灵芝的菌丝产物;经过GC-MS测定分析表明,与原种相比,含有ts基因的灵芝工程菌株有一个明显的差异峰,对该峰进行离子碎片分析表明,该物质为紫衫二烯,说明在含有ts基因的灵芝菌丝体中含有目标产物紫衫二烯。【结论】灵芝作为大型真菌,首次被证实可以通过代谢工程生产合成紫杉醇过程中的中间产物紫杉二烯,为以后紫杉醇的生产提供一个潜在的可能,对今后开展灵芝的分子生物学研究具有重要意义。

增强大肠杆菌MEP2通路发酵生产抗癌药物紫杉醇前体

用合成生物学的方法构建模块,使大肠杆菌遗传背景发生改变,生产红豆杉次生代谢产物紫杉醇前体物质——4(5),11(12)紫杉二烯(Taxadiene)。首先,用基因工程操作手段构建MEP2(2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate,2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径)模块,这个模块包括4个基因:ispC、ispE、ispH和ispG,4个基因的表达产物属于大肠杆菌固有途径中的几个酶蛋白;模块构建好后,通过电穿孔的方式把MEP2转化到已含有上游MEP1模块和下游TG模块的大肠杆菌中,改变大肠杆菌固有的遗传信息。再用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导所转入基因的表达,最后用气相色谱-质谱(GC-MS)方法检测表达情况。成功构建MEP2模块;通过与MEP1模块和TG模块的组合实验,MEP2模块能加强菌株表达紫杉二烯。结果表明,微生物大肠杆菌可以通过基因工程改造手段来生产植物天然药物紫杉醇前体物质4(5),11(12)紫杉二烯以及其他中间体。

牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达

紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。