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食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立 被引量:4
1
作者 曹冬梅 袁慕云 +1 位作者 许龙岩 曹际娟 《食品安全质量检测学报》 CAS 2013年第5期1451-1457,共7页
目的建立对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特异性检测toxR(跨膜转录激活蛋白)基因和tdh(热稳定性直接溶血素)毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman... 目的建立对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)特异性检测toxR(跨膜转录激活蛋白)基因和tdh(热稳定性直接溶血素)毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102cfu/mL。结论该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 toxR基因 tdh基因 双色荧光PCR 检测
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副溶血性弧菌致病性标志基因tdh的实时荧光定量聚合酶链式反应的建立 被引量:2
2
作者 王宏萍 周晓明 +3 位作者 张继伦 姜婷 李雯雯 鲍依稀 《第四军医大学学报》 北大核心 2008年第24期2232-2235,共4页
目的:建立一个用于副溶血性弧菌致病性定量测定的检测体系.方法:以多组tdh基因的保守序列为基础,设计实时荧光定量PCR扩增适用的引物和TaqMan探针.以定量方式提取副溶血性弧菌基因组DNA,以tdh+菌株为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法.... 目的:建立一个用于副溶血性弧菌致病性定量测定的检测体系.方法:以多组tdh基因的保守序列为基础,设计实时荧光定量PCR扩增适用的引物和TaqMan探针.以定量方式提取副溶血性弧菌基因组DNA,以tdh+菌株为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法.以tdh荧光定量结果与绝对菌数浓度作参比,以确定tdh基因在菌群中的拷贝水平.结果:使用正向序列5′-CGAAG ATGTT TATGG TCAAT C-3′(位置在467~487bp处),反向序列5′-ACCGC TGCCA TTG-TA TAGTC T-3′(位置在571~551bp处),TaqMan探针5′-FAM-TGACA TCCTA CATGA CTGTG AAC-ECLIPSE-3′(位置在517~539bp处)建立一个实时荧光定量PCR反应,目的片段长度105bp.建立反应的DNA拷贝数对数值与Ct值线性关系为y=-3.144logx+43.229(r=0.997,P<0.001).建立了菌液A值与显微镜下绝对菌数浓度的相关关系为y=2.0452x+6.2845(r=0.7828,P<0.01).根据tdh基因拷贝数与绝对菌数相比可计算tdh基因的单菌体拷贝量.结论:建立了一个定量副溶血性弧菌tdh基因拷贝水平的实时荧光定量PCR检测方法,可应用于副溶血性弧菌致病性的标准化定量测定体系. 展开更多
关键词 弧菌 副溶血性 聚合酶链反应 tdh基因
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副溶血性弧菌tdh基因的分子信标PCR技术检测 被引量:2
3
作者 万成松 谭翰清 温文川 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1475-1477,共3页
目的采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测。方法在反应体系中加入分子信标探针。对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测。结果2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114.9,95.2... 目的采用分子信标PCR技术进行副溶血性弧菌tdh基因检测。方法在反应体系中加入分子信标探针。对13株副溶血性弧菌和其他细菌分别进行tdh基因实时和终点法荧光检测。结果2株副溶血性弧菌和阳性质粒的终点法检测荧光值分别为114.9,95.2,90.0。实时PCR检测的CT值分别为26.2,26.8,32.0。其他肠道细菌终点法检测荧光值为47.0~69.1;CT值〉32.0或无值,与琼脂糖电泳分析结果一致。结论分子信标PCR技术可以准确、快速、实时、简便地进行副溶血性弧菌tdh基因检测。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌(VP) 分子信标 tdh基因 实时PCR
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荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tdh基因的表达差异 被引量:4
4
作者 王淑娜 方维焕 《畜牧与兽医》 北大核心 2008年第9期9-13,共5页
以pvuA为内标基因,运用实时荧光定量PCR检测不同来源以及不同应激条件下副溶血弧菌热稳定直接溶血素基因tdh的表达量。pvuA和tdh基因的荧光定量PCR融解曲线分析表明,两者均为特异性扩增。尽管相同来源的不同菌株间tdh表达量存在显著差异... 以pvuA为内标基因,运用实时荧光定量PCR检测不同来源以及不同应激条件下副溶血弧菌热稳定直接溶血素基因tdh的表达量。pvuA和tdh基因的荧光定量PCR融解曲线分析表明,两者均为特异性扩增。尽管相同来源的不同菌株间tdh表达量存在显著差异,副溶血弧菌临床分离株的tdh mRNA平均表达量显著高于海产品分离株((57.2比13.8)。在pH4.0、0.5%和8%NaCl应激条件下,临床株ZJ2和海产品分离株FJ14A的tdh mRNA表达量显著高于对照组;另一海产品分离株KP34在8%NaCl条件下的表达量显著提高,而低pH应激时tdh mRNA的表达量显著降低。结果表明,不同副溶血弧菌分离株的tdh mRNA表达差异显著,临床分离株的tdh mRNA表达量总体上高于海产品分离株,副溶血弧菌在不同应激条件下主要表现为tdh mRNA表达上调。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 荧光定量PCR tdh基因 表达差异
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聚合酶链反应检测粪便中的副溶血性弧菌的TDH基因
5
作者 任少堂 刘军民 +2 位作者 秦一中 汪伟业 俞守义 《上海医学检验杂志》 1997年第4期193-195,共3页
副溶血性弧菌是细菌性腹泻的主要致病因子.本研究建立一种快速标本处理和聚合酶链反应(PCR)诊断方法,扩增副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素(TDH)基因。对一组56例腹泻患者粪便标本进行了检测,经细菌培养证实为副溶血性弧菌的9份... 副溶血性弧菌是细菌性腹泻的主要致病因子.本研究建立一种快速标本处理和聚合酶链反应(PCR)诊断方法,扩增副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素(TDH)基因。对一组56例腹泻患者粪便标本进行了检测,经细菌培养证实为副溶血性弧菌的9份标本,PCR法均阳性;培养法明性的39例中,有7例检测到TDH基因.统计学表明两种方法检测结果相当一致,但检出能力PCR法显著高于培养法。本法简便、快速、特异,适宜临床应用. 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 聚合酶链反应 tdh基因
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TaqMan探针双重荧光PCR法检测副溶血性弧菌 被引量:12
6
作者 许龙岩 袁慕云 +1 位作者 曹际娟 凌莉 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第18期263-266,共4页
目的:建立同时检测副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法:根据VP的toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应扩增体系,进行特异性、敏感性实验,并用建立的方法检测从广东地区和辽宁地区进... 目的:建立同时检测副溶血性弧菌(VP)和其毒力基因的方法。方法:根据VP的toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立基于TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应扩增体系,进行特异性、敏感性实验,并用建立的方法检测从广东地区和辽宁地区进出口食品中分离的VP菌株的毒力基因分布情况。结果:VP标准菌株和3株从食物中毒病人中分离株均出现toxR基因和tdh基因扩增曲线,而31株包括溶藻弧菌、单增李斯特菌等弧菌属和肠杆菌科的菌株扩增结果呈阴性;敏感性实验结果表明,VP浓度与Ct值有很好的反向的线性关系,toxR和tdh线性方程的R2分别为0.999、0.997,最低检测浓度达到3.6×102CFU/mL;检测食品中分离的37株VP只出现toxR基因扩增曲线,未见tdh基因扩增曲线,表明37株VP分离株均未带tdh毒力基因。结论:建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中VP的特异性及毒力基因检测。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 toxR基因 tdh基因 TAQMAN探针 双重荧光聚合酶链式反应 检测 食品
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副溶血弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立 被引量:7
7
作者 孙宏迪 杜昕颖 +6 位作者 汪舟佳 王玉飞 宋宏彬 孙岩松 黄留玉 杨振洲 陈泽良 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期969-972,共4页
目的建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒... 目的建立一种快速检测副溶血弧菌的实时荧光定量PCR方法。方法根据副溶血弧菌tdh基因设计合成引物及TaqMan探针,利用阳性质粒和模拟标本建立副溶血弧菌实时荧光定量PCR检测方法。结果以副溶血弧菌DNA为模板克隆了tdh基因,得到阳性质粒。利用阳性质粒建立了定量PCR方法 ,得到标准曲线y=-4.9197x+58.72,决定系数(R2)为0.9864。此方法具有很好的特异性,在对15种肠道致病菌的检测中,只有副溶血弧菌基因组DNA的扩增结果为阳性。对粪便和食物模拟标本进行检测,敏感性均为102cfu/μl。此方法重复性较好,对4种浓度(105、104、103、102cfu/μl)的菌液各进行3次检测,结果均为阳性,且Ct值的变异系数<2%。结论建立了一种检测副溶血弧菌的荧光定量PCR方法 ,该法的敏感性和特异均较好,适用于快速、准确地检测食品和粪便中的沙门菌。 展开更多
关键词 弧菌 副溶血性 基因 tdh 实时定量聚合酶链反应 DNA探针
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菌落PCR方法的建立及其与常规PCR方法的比较 被引量:15
8
作者 徐丽 蔡俊鹏 《华南理工大学学报(自然科学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第5期51-55,共5页
为建立一种快速、经济、敏感的PCR检测方法 ,以直接检测出环境、海产品等中的靶基因 ,通过PCR扩增已知携带tlh和tdh基因的副溶血弧菌标准菌株 ,并和常规PCR方法比较 ,初步建立了菌落PCR技术 ;再以副溶血弧菌标准菌株为阳性对照 ,以本实... 为建立一种快速、经济、敏感的PCR检测方法 ,以直接检测出环境、海产品等中的靶基因 ,通过PCR扩增已知携带tlh和tdh基因的副溶血弧菌标准菌株 ,并和常规PCR方法比较 ,初步建立了菌落PCR技术 ;再以副溶血弧菌标准菌株为阳性对照 ,以本实验室自海洋环境中分离得到的数株野生菌株为检测对象 ,采用新建立的菌落PCR以及常规PCR方法对它们进行扩增比较 ,进一步证明了菌落PCR技术检测携带相关基因菌株的可靠性 .通过比较 ,发现菌落PCR和常规PCR的结果相当一致 。 展开更多
关键词 菌落PCR 常规PCR tdh基因 tlh基因
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海水产品副溶血性弧菌污染定量检测分析 被引量:26
9
作者 程苏云 张俊彦 +2 位作者 王赞信 童贵忠 孟真 《中国卫生检验杂志》 CAS 2007年第2期336-338,共3页
目的:为了掌握副溶血性弧菌在海水产品中污染情况,以不同季节,定量检测副溶血性弧菌在海水产品中污染程度的动态变化,提出有效的控制措施,减少食物中毒的发生。方法:根据不同季节,从不同的农贸市场采取鱼类、虾类标本;采用MPN法进行副... 目的:为了掌握副溶血性弧菌在海水产品中污染情况,以不同季节,定量检测副溶血性弧菌在海水产品中污染程度的动态变化,提出有效的控制措施,减少食物中毒的发生。方法:根据不同季节,从不同的农贸市场采取鱼类、虾类标本;采用MPN法进行副溶血性弧菌定量检测;并完成分离菌株血清型和毒力基因的检测。结果:副溶血性弧菌在海水产品中的污染有明显的季节性,并且与我省的细菌性食物中毒的发生季节基本一致;副溶血性弧菌的血清型分布以O4/O5/O1/O11血清型为主;海产品分离株,其携带TDH基因明显低于食物中毒标本中分离株。结论:通过检测分析,得出副溶菌在鱼虾等海产品中的污染具有明显的季节性,虾和鱼的污染密度也有差别(2χ=12.40;P<0.05)。而且检测的两类海产品中,高污染量的副溶菌对食品安全存在高风险。加强对TDH阳性副溶菌的检测,是控制副溶菌食物中毒发生的重要方面。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 定量检测 血清型 毒力基因(tdh)
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用PCR检测副溶血性弧菌耐热溶血素基因 被引量:2
10
作者 周志江 刘纯杰 +3 位作者 黄上媛 中野克重 佐藤久聪 齐藤博 《中国兽医学报》 CAS CSCD 1996年第3期252-255,共4页
根据副溶血性弧菌的耐热溶血素基因(tdh)设计了2对引物,经聚合酶链式反应(PCR)检测,所有18株神奈川试验阳性副溶血性弧菌均呈阳性反应,而6株神奈川试验阴性副溶血性弧菌呈阴性反应,其他9种(34株)弧菌和8株其他... 根据副溶血性弧菌的耐热溶血素基因(tdh)设计了2对引物,经聚合酶链式反应(PCR)检测,所有18株神奈川试验阳性副溶血性弧菌均呈阳性反应,而6株神奈川试验阴性副溶血性弧菌呈阴性反应,其他9种(34株)弧菌和8株其他革兰氏阴性菌也呈阴性反应。检测敏感性可达2CFU的副溶血性弧菌。 展开更多
关键词 PCR 副溶血性弧菌 耐热溶血素基因
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致病性副溶血性弧菌特异性三重PCR检测方法研究
11
作者 金雷 陈瑜 +1 位作者 张小军 施慧 《安徽农业科学》 CAS 2017年第14期132-133,140,共3页
[目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通... [目的]建立同时检测致病性副溶血性弧菌gyrase、tdh、toxR基因的三重PCR快速检测方法。[方法]用3种基因的特异性引物分别对副溶血性弧菌ATCC33847的模板DNA进行单一扩增,找到各自引物最佳扩增条件;再用3种引物同步对模板DNA进行扩增,通过优化引物浓度、引物间比例以及退火温度,建立最佳扩增体系。[结果]在最佳三重PCR反应条件下,gyrase、tdh和toxR能同时扩增出清晰条带,大小分别为91、269和368 bp。[结论]该研究为致病性副溶血性弧菌的快速检测提供了一种新的技术方法。 展开更多
关键词 致病性副溶血性弧菌 三重PCR gyrase基因 tdh基因 toxR基因
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基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌 被引量:5
12
作者 王淑娜 周向阳 +5 位作者 胡兴娟 沈飚 贝文联 朱应伟 陈健舜 方维焕 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期455-458,共4页
目的建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌。结果副溶血弧菌可得到... 目的建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌。结果副溶血弧菌可得到特异性扩增,而其它与副溶血弧菌共存于海产品中的细菌均未见扩增曲线。副溶血弧菌与其它细菌的混合DNA检测表明,其它细菌基因组的存在时并不干扰副溶血弧菌检测。副溶血弧菌典型菌株FJ14和BJ97的敏感性试验显示,该体系的最低检测DNA浓度分别为49.8pg与77.8pg,最低检测细菌浓度为56CFU/mL和371CFU/mL。对舟山菜市场采集的50份样本检测表明,32份为tlh基因阳性,3份为tdh基因阳性,与传统方法的检测结果相同。结论与传统检测方法相比,副溶血弧菌的双重荧光定量PCR检测方法快速准确,结果直观。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 tlh基因 tdh基因 双重荧光定量PCR
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沿海地区副溶血弧菌的表型及其主要毒力基因分布特征 被引量:1
13
作者 周向阳 王淑娜 +1 位作者 周秀锦 方维焕 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第1期192-195,共4页
为了调查浙江沿海地区副溶血弧菌的分布及其携带毒力基因的特征,在舟山、象山、温州三地实地采样385份,包括海水、泥土和水产品等,共分离到副溶血弧菌菌株278份,其中27株为tdh基因阳性,阳性率为9.7%,trh与ureC基因的阳性率分别为22.3%与... 为了调查浙江沿海地区副溶血弧菌的分布及其携带毒力基因的特征,在舟山、象山、温州三地实地采样385份,包括海水、泥土和水产品等,共分离到副溶血弧菌菌株278份,其中27株为tdh基因阳性,阳性率为9.7%,trh与ureC基因的阳性率分别为22.3%与11.8%,提示浙江沿海地区广泛存在着致病性副溶血弧菌污染。将不同来源副溶血弧菌的tdh和trh基因进行序列测定,进化树分析发现,环境分离株中tdh基因与临床分离株中tdh基因区分为2簇,而环境分离株与临床分离株中trh基因之间却没有明显的差异。研究结果可为浙江沿海地区副溶血弧菌的风险评估提供参考。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 环境分离株 tdh基因 trh基因 ureC基因
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副溶血弧菌海产品分离株tdh基因及其临近区域结构分析 被引量:5
14
作者 王淑娜 Khamphouth VONGXAY +4 位作者 沈飚 周向阳 金培婕 陈健舜 方维焕 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1576-1583,共8页
【目的】初步探索副溶血弧菌海产品分离株tdh基因区域的结构特征。【方法】采用长距离PCR和基因步移技术进行tdh基因侧翼序列扩增,测序验证后拼接成疑似毒力基因片段,将所获序列与NCBI数据库进行比较,初步明确tdh基因侧翼序列的结构与... 【目的】初步探索副溶血弧菌海产品分离株tdh基因区域的结构特征。【方法】采用长距离PCR和基因步移技术进行tdh基因侧翼序列扩增,测序验证后拼接成疑似毒力基因片段,将所获序列与NCBI数据库进行比较,初步明确tdh基因侧翼序列的结构与功能。【结果】海产品分离株ZS34与参考菌株RIMD2210633的tdh基因区域(VPA1310-VPA1327)结构基本一致,核苷酸同源性达98.3%;而FJ14与WZ64株基因组中的tdh基因均与tdh3的同源性最高,在基因组中的位置也不同于ZS34株和参考菌株。FJ14基因组中的tdh与trh-ure基因簇相连,tdh与trh基因间的距离约为15kb,中间分散着类插入序列;菌株WZ64没有trh基因,但tdh基因上游也有类插入序列。【结论】副溶血弧菌海产品分离株tdh基因区域具有多态性且存在类插入序列,是毒力基因水平转移的佐证。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 tdh基因 类插入序列 基因水平转移
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荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tlh和tdh基因的表达差异 被引量:10
15
作者 陈星 潘迎捷 +1 位作者 孙晓红 赵勇 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期1077-1083,共7页
副溶血弧菌是广泛存在于近海区域,盐湖和海产品中的食源性致病菌,会引起大规模的食物中毒。TLH(不耐热溶血毒素)和TDH(耐热直接溶血毒素)是副溶血弧菌最主要的毒力基因,通过比较毒力基因的表达量可以间接比较同种菌株在不同应激条件下... 副溶血弧菌是广泛存在于近海区域,盐湖和海产品中的食源性致病菌,会引起大规模的食物中毒。TLH(不耐热溶血毒素)和TDH(耐热直接溶血毒素)是副溶血弧菌最主要的毒力基因,通过比较毒力基因的表达量可以间接比较同种菌株在不同应激条件下以及不同菌株之间的毒力差异。本文以在不同条件下培养的3株Vp为材料,分别提取其总RNA,以16S rRNA为内标基因,运用荧光定量PCR技术检测副溶血弧菌TLH和TDH基因在不同应激条件下的表达差异。结果表明:不同菌株和同种菌株在不同应激条件下tlh、tdh基因表达差异均显著;tlh的最适表达条件分别为5%盐度和20°C;tdh的最适表达条件分别为1%盐度和25°C。运用SPSS软件对实验结果进行统计学分析表明:菌株对tlh表达的影响大于盐度大于温度;菌株对tdh表达的影响大于温度大于盐度。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 tlh tdh RT-PCR 基因表达
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副溶血性弧菌耐热性直接溶血素(TDH)的研究进展 被引量:9
16
作者 檀利军 王敬敬 +2 位作者 石千黛 刘海泉 赵勇 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期1563-1573,共11页
副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海产品中一种常见的食源性致病菌,常导致水产养殖动物患病或者引起食物中毒。耐热性直接溶血素(thermotolerant direct hemolysin,TDH)是副溶血性弧菌最为重要的致病因子之一。本文围绕tdh基因... 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是海产品中一种常见的食源性致病菌,常导致水产养殖动物患病或者引起食物中毒。耐热性直接溶血素(thermotolerant direct hemolysin,TDH)是副溶血性弧菌最为重要的致病因子之一。本文围绕tdh基因在弧菌属中的广泛分布与传播、tdh基因的多样性及其表达调控、TDH的蛋白结构及其生物活性进行了综述,并对未来TDH的研究方向进行了展望。旨在进一步了解由副溶血性弧菌感染所引起的病症,为预防副溶血性弧菌的感染和临床治疗提供理论支撑。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 耐热性直接溶血素 tdh基因 结构 表达调控 生物活性
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特异性三重PCR快速检测副溶血性弧菌 被引量:7
17
作者 陈丽萍 刘忠民 +2 位作者 陈芸 张继伦 彭云霞 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期764-775,共12页
【目的】建立同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速检测方法。【方法】将已报道的这3种基因的引物加入一个PCR反应管中,对引物浓度和退火温度进行优化,找到最佳引物比例和扩增条件。通过特异性验证、灵敏度验证以及... 【目的】建立同时检测副溶血性弧菌gyrase、tdh、trh基因的三重PCR快速检测方法。【方法】将已报道的这3种基因的引物加入一个PCR反应管中,对引物浓度和退火温度进行优化,找到最佳引物比例和扩增条件。通过特异性验证、灵敏度验证以及方法间对比进行方法确认,其PCR产物使用全自动毛细管电泳分析系统进行分析。【结果】仅在91、269、485 bp处分别出现预期DNA扩增条带;纯培养条件下,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×101、6.6×102和6.6×101 CFU/mL;本底干扰物存在时,扩增gyrase、tdh、trh的菌浓度检测限分别为6.6×103、6.6×104和6.6×103 CFU/mL;模板DNA浓度检测限为1.36μg/L。检测进境海产品时,检测结果和FDA 2004标准结果一致,且更易辨认和判断。【结论】此检测方法的成功建立,为副溶血性弧菌及携带tdh和/或trh基因的致病性副溶血性弧菌的检测提供了一种准确、高效、便捷的分子技术手段。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 三重PCR gyrase基因 tdh基因 trh基因 全自动DNA毛细管电泳
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四重PCR检测副溶血性弧菌及其毒力基因方法的建立 被引量:6
18
作者 林佳琪 苏国成 +2 位作者 黄建炜 陈泽辉 周常义 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期2521-2529,共9页
【目的】建立同时检测副溶血性弧菌tox R、tdh、trh、tlh基因的四重PCR快速检测方法。【方法】分别以副溶血性弧菌的tox R、tdh、trh、tlh 4个基因为靶基因,设计4对特异性引物,对4对引物浓度和退火温度进行优化,获得最佳引物比例和扩增... 【目的】建立同时检测副溶血性弧菌tox R、tdh、trh、tlh基因的四重PCR快速检测方法。【方法】分别以副溶血性弧菌的tox R、tdh、trh、tlh 4个基因为靶基因,设计4对特异性引物,对4对引物浓度和退火温度进行优化,获得最佳引物比例和扩增条件,建立快速检测致病性副溶血性弧菌的四重PCR体系。通过特异性验证、灵敏度验证以及模拟样品检测进行方法确认。【结果】四重PCR体系扩增条带与预期相符,即115 bp(tox R)、244 bp(tdh)、418 bp(trh)、759 bp(tlh)4个目的条带;用74株副溶血性弧菌和37株非目标菌的测试结果表明,所建立的方法有良好的特异性。该方法对模板DNA的检测灵敏度为50μg/L,纯培养物的检测灵敏度为6.7×103 CFU/m L;副溶血性弧菌含量为1.36 CFU/g的人工模拟样品增菌6 h后,tox R、tlh、tdh、trh 4个基因可同时被检出。【结论】该方法可实现同时检测携带tox R、tdh、trh、tlh 4种基因的副溶血性弧菌,对开展致病性副溶血性弧菌的检测研究具有一定现实意义。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 四重PCR toxR基因 tdh基因 trh基因 tlh基因
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应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因 被引量:7
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作者 卢昕 徐嘉良 +1 位作者 阚飙 逄波 《中国预防医学杂志》 CAS 2012年第4期241-245,共5页
目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价... 目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价。根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价。结果本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性。毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl。结论本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景。 展开更多
关键词 副溶血弧菌 SYBR Green Ⅰ荧光PCR tlh基因 trh基因 tdh基因
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感染性腹泻中副溶血性弧菌的监测与研究 被引量:11
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作者 张建群 罗学辉 +1 位作者 何水渊 张怡明 《中国卫生检验杂志》 CAS 2010年第2期376-378,共3页
目的:了解余姚市感染性腹泻中副溶血性弧菌的感染状况及其研究。方法:采集感染性腹泻病人的大便或肛拭标本,依据GB/T4789.7进行增菌、分离、生化鉴定、血清分型,最后进行药敏试验和PCR毒力基因检测。结果:2007-2008年共检验标本513份... 目的:了解余姚市感染性腹泻中副溶血性弧菌的感染状况及其研究。方法:采集感染性腹泻病人的大便或肛拭标本,依据GB/T4789.7进行增菌、分离、生化鉴定、血清分型,最后进行药敏试验和PCR毒力基因检测。结果:2007-2008年共检验标本513份,检出副溶血性弧菌43株,检出率为8.38%。药敏试验:43株副溶血性弧菌对阿莫西林棒酸、青霉素、氨苄西林、环丙沙星、头孢唑林、头孢哌酮、庆大霉素7种抗生素的耐药率分别为58.1%、55.8%、、44.2%、7.0%、4.7%、4.7%、4.7%,对另外13种抗生素均敏感。血清分型:43株副溶血性弧菌分布于O1、O2、O3、O4、O6、O11共6个O抗原群;其中以03群为主,占67.4%。毒力基因:有40株副溶血性弧菌检出含有tdh基因,检出率高达93.02%,均未检出trh基因。结论:检出的副溶血性弧菌以03群为主,占67.4%;对阿莫西林棒酸、青霉素耐药性最强,分别为58.1%、55.8%;93.02%的菌珠含有tdh基因,所有菌株均不含trh基因。 展开更多
关键词 副溶血性弧菌 血清分型 耐药 tdh基因 trh基因
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