耐盐转基因大豆事件AtARA6-A001外源插入片段侧翼序列及其应用

转基因大豆AtARA6-A001事件采用农杆菌介导大豆遗传转化法获得,其受体为沈农9号,具有耐盐特性,目前已经进入环境释放阶段。为明确该转基因大豆材料的分子特征及其转基因检测方法,推进该转基因事件生物安全评价工作。本研究以转基因大豆AtARA6-A001为研究对象,利用Southern杂交方法及基因组重测序技术鉴定了外源基因的拷贝数及插入位点的位置和方向。同时利用PCR扩增技术获得了外源T-DNA的左右侧翼序列,并基于左右旁侧序列,建立了转AtARA6基因耐盐大豆A001事件的特异性定性PCR检测方法。此方法能特异性检测转基因大豆植株AtARA6-A001根、茎、叶、花和种子样品,并且能够特异性识别转基因大豆事件的身份,这为后续转基因大豆及其产品的检测和监管提供技术支持。

应用Tail-PCR分析sul1和tetW侧翼功能序列

目的基于对抗生素抗性基因(sul1和tetW)侧翼序列分析,为研究其水平或垂直传递相关保守元件和机制提供方法学基础和理论依据。方法运用普通PCR对天津海河流域底泥中抗性基因进行定性分析,以多个样品的总DNA提取物为模板,运用Tail-PCR扩增分析sul1、tetW的侧翼序列。结果磺胺类和四环素类抗性基因sul1和tetW普遍存在,并获得了sul1的左侧序列1 100 bp,tetW右侧序列两条为608 bp、862 bp。结论通过序列分析发现了多种保守结构域相关序列,以及全新的序列特征,结果表明磺胺抗性基因与氨基糖苷类药物抗性基因存在连锁现象,四环素抗性基因与TnB1230存在连锁,并成功摸索了从混合模板中Tail-PCR获取特定位点多个侧翼序列的方法。

转基因玉米ND207转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化

转基因玉米ND207是中国农业大学研发的转mCry1Ab和mCry2Ab基因的抗虫玉米,本研究的目的是建立ND207转化事件特异性定性PCR检测方法。根据研发者提供的引物进行PCR扩增,PCR产物测序分析,获得了5’端旁侧序列262 bp,包括109 bp的载体序列和153 bp的玉米基因组序列, 3’端旁侧序列316 bp,包括76 bp的载体序列和240bp的玉米基因组序列。针对两端旁侧序列设计14条引物,组成25对引物组合进行引物筛选,选中3’端一对最佳引物优化PCR反应体系及反应条件,建立ND207的转化事件特异性定性PCR检测方法, PCR产物片段大小为166 bp。经过测试,该方法的检出限为0.1%,相当于20个拷贝的ND207特异分子片段。国内8家转基因生物安全检测机构对本方法进行了特异性测试、检出限测试和再现性测试,循环验证报告显示:该方法符合国家标准方法的各项要求,可在检测行业推广应用。ND207转化事件特异性定性PCR检测方法的建立,为我国ND207及其衍生品系的安全监管提供技术支撑。

大豆转化体E8A7027外源T-DNA分析及特异性检测体系建立

为进一步分析转AgGlpF基因耐盐转基因大豆E8A7027转化体的分子特征信息并对其进行特异性检测,本研究分离该转化体的旁侧序列并建立其特异性PCR检测体系。基于基因组重测序技术并结合Sanger测序技术,将基因组重测序分析获得的序列信息与参考大豆基因组进行对比,确定E8A7027转化体的T-DNA区在大豆基因组上的插入位点及其5′端和3′端的旁侧序列。根据旁侧序列设计PCR检测引物,并对检测体系的特异性、灵敏度进行实验室内验证。结果显示:转基因大豆E8A7027的整合位点为Chr09染色体的33886331位点,整合方式为单拷贝插入,受体基因组DNA在插入位点缺失了1段58 bp序列,分别获得E8A7027大豆的5′端旁侧序列910 bp和3′端旁侧序列802 bp。根据这两个旁侧序列设计引物建立的PCR检测方法,能够特异性地将E8A7027大豆转化体与其他转基因作物和非转基因大豆区分开,方法的检测灵敏度为0.05%。研究结果可为E8A7027转化体的安全评价和监管检测提供技术支撑。

甘蔗镰孢菌插入突变体库的构建、致病变异突变体筛选及突变基因定位

由镰孢菌复合种引起的甘蔗梢腐病(pokkah boeng disease,PBD)是甘蔗的主要病害之一。在广西,甘蔗镰孢菌(Fusarium sacchari)是PBD的优势病原菌。尽管PBD的研究已有较长的历史,但甘蔗镰孢菌的致病分子机理远未得到阐明。为研究甘蔗镰孢菌的致病分子机理,本研究采用农杆菌介导的遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)技术构建甘蔗镰孢菌FF001菌株的T-DNA插入突变体库。采用携带潮霉素B磷酸转移酶基因pTHR1-AH双元载体的农杆菌菌株AGL-1介导转化F.sacchari分生孢子,获得3018个转化子;随机选取12个转化子进行PCR检测和Southern杂交分析,结果显示所有检测突变株均插入潮霉素B磷酸转移酶基因,多数为单拷贝插入。采用离体叶片接种评价转化子的致病力,获得致病力明显减弱21个和致病力增强9个,共30个突变体。通过TAIL-PCR扩增测序并与甘蔗镰孢菌基因组序列比对,确定了其中27个突变株的T-DNA插入位点。观察到多个插入位点伴随有基因组片段缺失,导致1个插入位点可以影响1个以上的功能基因。T-DNA插入位点多为编码区和启动子区,少数为终止子区和间隔区。受影响的基因分别编码α-甘露糖苷酶(alpha-mannosidase)、中性氨基酸渗透酶(neutral amino acid permease)、寡聚高尔基复合体成分4(oligomeric golgi complex component 4)、寡肽转运蛋白(oligopeptide transporter)、酰基辅酶A脱氢酶(acyl-CoA dehydrogenase)、乙酰乙酰-CoA合成酶(acetoacetyl-CoA synthetase)、碳酐酸酶(carbonic anhydrase)、Bud 10蛋白(Bud 10 protein)、类驱动蛋白bimC(kinesin-related protein bimC)、锌指蛋白ASD4(zinc finger protein ASD4)、转录起始因子TFIID(transcription initiation factor TFIID)、角质酶G-box结合蛋白(cutinase G-box binding protein)、吖啶黄素敏感性控制蛋白(acriflavine sensitivity control protein ACR-2)、核类VCP蛋白(nuclear VCP-like protein)、热激蛋白HSP30(heat shock protein 30)、硫氧还蛋白(thioredoxin)、2C型蛋白磷酸酶(type 2C protein phosphatase)、核糖核酸外切酶(exoribonuclease)、硒蛋白(selenoprotein)、DNA聚合酶η(DNA polymerase eta)、存活因子1(survival factor 1)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase)等22个已知功能蛋白和16个未知功能蛋白。部分突变基因,如锌指蛋白ASD4、角质酶G-box结合蛋白、寡肽转运蛋白和2C型蛋白磷酸酶等,已分别在稻瘟病菌、稻曲病菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰孢菌等植物病原真菌中证实为致病相关基因。多种类型致病相关突变体的获得,为深入研究甘蔗镰孢菌致病分子机理提供了新的材料。

基于重测序鉴定耐盐转基因大豆事件外源T-DNA整合位点及特异性检测

[目的]转基因大豆事件L8014是本研究前期利用农杆菌介导的大豆子叶节高效遗传转化技术体系,将来源于山菠菜的基因BADH导入大豆(Glycine max)‘Williams 82’而获得具有良好耐盐(1.5%NaCl)性状的转基因大豆(该材料已经完成环境释放试验)。T-DNA插入位点侧翼序列的获得与分析对于转基因事件的安全评价及应用非常重要,本文旨在明确该转基因大豆材料的分子特征及其检测方法,以进一步推进安全评价。[方法]利用Southern杂交检测转基因大豆外源基因的拷贝数;基于基因组重测序技术,采用BWA(Burrows-Wheeler-Alignment)方法将重测序数据与T-DNA序列以及大豆基因组序列进行比对分析。[结果]T-DNA在大豆基因组10号染色体上的基因组区间3925017—3926022位点,插入方式为反向插入;结合PCR扩增技术获得外源T-DNA整合位点的左、右边界侧翼序列,基于该序列建立了转BADH基因大豆事件L8014的特异性PCR检测方法。[结论]本研究获得了转基因事件的整合位点及侧翼序列,方法快速、结果可靠,为转基因大豆及其衍生产品的检测提供了技术支撑。

大丽轮枝菌(Verticillim dahliae)突变体库的构建与分析

为了更加快捷地筛选大丽轮枝菌致病关键基因,利用聚乙二醇介导的原生质体转化法构建病原菌随机插入突变体库,对部分阳性转化子的生长表型指标和致病力进行分析,筛选生长发育与致病缺陷突变体并进行靶标基因定位。结果表明,本研究共获得13030多个阳性转化子,随机挑选5个转化子与V991野生型菌株进行比较分析,发现其中一个突变体在PDA和不同碳源培养基上的菌落直径、产孢量以及致病力均显著降低。侧翼序列测序结果结合Blast比对分析表明,该缺陷突变体中的潮霉素抗性基因表达盒定位于大丽轮枝菌3号染色体1528782 bp处,属于内切葡聚糖酶1基因(VDAG_04017)。综上所述,本研究通过大丽轮枝菌插入突变体库构建、突变体生长表型指标和致病力鉴定及靶标基因定位等一系列分子生物学手段,可初步鉴定病原菌致病相关基因,为从全基因组层面深入研究大丽轮枝菌致病机制奠定了一定基础。

转基因抗虫棉Bt基因插入区碱基组成分析

利用TAIL PCR的方法克隆不同来源的转基因抗虫棉中外源基因插入区的侧翼序列并对其进行序列和结构分析。结果表明 :同一个转基因的单株自交得到的不同株系中外源基因插入区的两侧DNA序列完全相同 ,不同的转基因抗虫棉中的外源基因插入位置各不相同。不同来源的转基因品种外源基因插入的上游侧翼片段含有一段残留质粒片段 ,外源基因插入的下游侧翼片段为富含AT碱基结构 ,其中泗棉 3号转基因抗虫品系中下游侧翼片段的AT碱基高达 92 %。Southern杂交结果显示这些侧翼序列为高AT含量的多拷贝序列 。

山羊FSHR基因5'端侧翼序列的克隆与分析

为找寻山羊FSH受体基因的SNP突变位点,进行FSH受体基因的多态性分析和探索该受体基因在山羊多胎中的可能作用,利用比较基因组学的方法,根据绵羊FSH受体基因序列设计引物,以湖南湘东黑山羊基因组为模板,PCR扩增了FSH受体基因5' 端侧翼调控区,通过克隆进行了序列测定及分析,并与牛、绵羊该区段序列进行了比较.结果表明,PCR扩增获得的片段为844 bp,与中国西门塔尔牛该段序列相比,同源性为94.08%,在-364 bp处的左翼发生了多碱基插入,湘东黑山羊该序列有5个碱基的插入,另在-625^-619 bp处的7个碱基缺失;与澳洲绵羊的FSHR基因比较,同源性为93.60%,在-367 bp处的左翼,湘东黑山羊该段序列有2个碱基的插入,在-630,-145,-97 bp 处各有1个碱基缺失.

改进的反向PCR技术克隆转移基因的旁侧序列

对传统的反向ＰＣＲ 技术作了一些改进： 用巢式ＰＣＲ 扩增含量极少的靶序列； ＰＣＲ 反应体系中加入５ ％ 的甲酰胺以减少非特异性扩增． 结果表明， 改进的反向ＰＣＲ 体系是克隆人基因组已知片段旁侧序列的高度灵敏、高度特异的方法．

大豆二核苷酸SSR侧翼序列保守性分析

从NCBI下载了大豆的EST和GSS序列,以SSR两侧序列各100 nt的片段作为分析材料,统计SSR数目、计算侧翼序列碱基组成,对SSR侧翼序列进行了序列比对和数据库blast搜索。结果表明:大豆SSR分布频率为1/6.67kb,侧翼序列GC含量为37.83%,二核苷重复是SSR的主要类型(65.7%),同一种重复基元的SSR存在多类型侧翼序列,同一类型的侧翼序列高度保守,不同类型的侧翼序列之间相似性较小,尤其是非SSR区域可以存在与SSR侧翼序列相同的序列。由上述结果推断SSR引物可能扩增出不含SSR的产物,易位可以产生形成新类型SSR。这一分析结果有助于提高SSR引物设计效率和进一步阐明SSR的形成机理。

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析

【目的】为鉴定棉花黄萎病菌随机插入突变体的表型特征,构建黄萎病菌遗传转化和功能基因研究的技术平台。【方法】采用农杆菌介导的T-DNA插入和高效TAIL-PCR方法。【结果】获得了2628个棉花黄萎病菌VD991的T-DNA随机插入的突变体和15个突变体插入位点的侧翼序列。部分突变体的表型特征和插入位点侧翼序列分析表明,①突变体的菌落形态分为菌丝型、菌核型和中间型3类,菌核型约占7.3%;②在摇瓶培养条件下,突变体产孢高峰在接种后第5—6天,菌核型突变体的产孢能力普遍高于菌丝型;③棉花黄萎病菌VD991可以产生胞外蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶。筛选获得蛋白酶分泌缺失的突变体3个,淀粉酶分泌缺失的突变体1个,果胶酶分泌降低的突变体6个;④菌核型突变体的致病力普遍高于野生型。获得了6个致病力减弱的突变体;⑤突变体侧翼序列与同种的大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组的序列一致性在95%—100%之间,与不同种的黑白轮枝菌VaMs.102序列的一致性为87%—94%。【结论】农杆菌介导的T-DNA随机插入可用于棉花黄萎病菌突变体的构建,突变体微菌核的产生与其产孢能力、致病性存在相关关系。美国大丽轮枝菌菌株VDLs.17基因组可用作黄萎病菌VD991功能基因研究的参考序列。

鳜鱼(Siniperca chuatsi)β-肌动蛋白基因cDNA全序列与5′侧翼区的克隆与分析

采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆鳜鱼β-肌动蛋白基因cDNA全序列,再用基因组步行法(Genome Walker)克隆鳜鱼β-肌动蛋白基因5′调控区。序列分析结果表明,鳜鱼β-肌动蛋白基因全长1897bp,其中5′-UTR长94bp,3′-UTR长675bp,编码区长1128bp,编码375个氨基酸。将所得序列与其它动物类群的β-肌动蛋白基因序列进行比较分析显示,鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类等不同类群脊椎动物β-肌动蛋白氨基酸序列同源性均在96%以上,说明该基因在生物进化过程中高度保守。通过鳜鱼与其它脊椎动物β-肌动蛋白基因的核苷酸序列构建的进化树显示,脊椎动物β-肌动蛋白聚类成3个分支,鱼类β-肌动蛋白基因形成一个独立的分化群,说明鱼类β-肌动蛋白基因起源于一个共同祖先。克隆得到的鳜鱼β-肌动蛋白基因5'侧翼序列长1399bp,对其进行序列分析,在其起始密码字ATG上游200bp范围内发现含有CAATbox、CC(A/T)6GG(CArGbox)、TATA box对转录调控起重要作用的顺式元件,同时在侧翼区也发现含有GC box、MYOD、YY1、SP1、GATA等多个潜在调控元件。鳜鱼β-肌动蛋白基因5′侧翼序列的克隆成功,为今后转基因鳜鱼的研究工作奠定了基础。

外源抗草甘膦EPSPs基因在大豆基因组中的整合与定位

通过基因特异引物扩增和免疫层析试纸法分别对转基因大豆中外源EPSPs基因和其编码的蛋白进行检测,结果表明,EPSPs基因不仅已整合到大豆基因组中,而且EPSPs蛋白可以正常表达。利用染色体步移法获得了转基因大豆插入位点的侧翼序列,序列比对表明35S上游的大豆DNA序列起始于Gm02:7912740,NOS下游的大豆DNA序列起始于Gm02:7777705。在本研究检测序列范围内发现插入位点两侧不同位置有3个不同的未知片段、2个大豆基因组序列倒位,同时发现2个大豆基因组片段丢失。外源基因不是以点插入方式整合,而是导致大豆基因组约135kb片段的移位;NOS下游大豆基因组序列发生重排,导致一个编码HEC1和HEATrepeat两个功能域的基因(Glyma02g09790)结构受到影响,首次发现该基因在ABA和PEG处理时下调表达,推测该基因通过ABA信号通路参与胁迫应答。本研究通过对抗除草剂EPSPs基因在大豆基因组中的插入位点分析,明确了外源EPSPs基因在大豆基因组中的整合、定位及其侧翼序列,为转基因大豆安全评价提供了依据。

水稻T-DNA插入突变体库的筛选及遗传分析(英文)

T-DNA标签技术是分离和研究植物功能基因的有效方法,寻找T-DNA插入表型突变体是进一步开展研究的关键所在。文章对以ZH11、ZH15为受体亲本构建的4416份T1代标签系进行了表型鉴定,发现存在拟纯合突变和系内分离突变两种类型,突变表型涉及株高、生育期、叶形、叶色、分蘖力、植株松紧度、穗颈节、穗形、颖花、粒形、类病变、雄性不育、生长极性等14类性状。其中,株高、生育期、叶色、雄性不育有着相对较高的突变频率(超过1%),株高和叶色的突变频率在品种及年度问表现稳定,而生育期、雄性不育波动较大,表明这类性状的表型易受到环境的影响。通过T1、T2连续世代的共分离分析,筛选出3个与穗部或颖花发育相关的T-DNA插入突变体,为分离相关功能基因奠定基础。随机选择42份有表型突变的标签系,通过质粒拯救和TAIL-PCR的方法分离其侧翼序列,从39个标签系中获得40条序列,其中25条为载体序列,14条与水稻基因组有很好的同源性,BlastN分析结果表明T-DNA有优先整合进植物功能基因内部的特性。

获得基因侧翼序列位点信息的几种扩增方法

侧翼序列是指染色体中特定位点两侧的DNA序列。在现代分子生物学技术研究中,常常需要对已知位点的侧翼序列进行分析或克隆,以研究基因的遗传表达调控。该文对近年来发展的几种侧翼序列扩增技术进行简述。

转HAL1基因大豆侧翼序列分析及特异性检测方法研究

为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L^(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g^(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。

两个不同来源的番茄GGPS基因克隆和序列分析

据本实验室得到的GGPS基因片段与NCBI公布的GGPS基因cDNA(DQ267903)序列设计引物,以两份番茄红素含量差异显著的番茄材料:普通番茄(编号E6203)和源于多毛番茄的渐渗系(编号TA517)为试材,分别克隆其DNA和cDNA序列。序列分析显示:GGPS基因不含有内含子。所推导氨基酸序列比对表明:2个不同来源的GGPS基因存在13个差异位点,其中9个位点的氨基酸性质发生了变化。氨基酸变异导致了2个GGPS基因的二级结构与磷酸化位点的不同,初步推测番茄红素含量的差异可能与氨基酸变异有关;采用双链接头介导的染色体步移技术,克隆了GGPS基因5′侧翼序列,进一步分析结果显示:两份材料GGPS上游区序列差异明显,但所包含的顺式元件的分布相对保守,且存在明显的转录调控序列;利用RT-PCR方法对不同器官的GGPS基因表达进行初步研究,结果表明:GGPS基因主要在果实和花器官中表达。

反向PCR克隆转基因水稻的外源基因旁侧序列

以反向PCR(IPCR)为基础建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序列的技术体系。该方法中用小量法提取转基因水稻总DNA ;总DNA用 10倍过量的限制性内切酶在 50 μL反应体积中进行过夜酶切 ;酶切片段在 2 0 μL体积中进行自连接 ,之后进行套式PCR(nested PCR)扩增旁侧序列。在套式PCR中结合了热启动PCR和降落PCR技术以增强PCR反应的特异性。用这种方法 ,本实验室在一周内克隆了 35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列 ,长度在 30 0～ 750bp之间 ,PCR产物的特异性用Southern杂交进行了证明。实验结果表明这个方法具有快速、稳定和高效的优点。

转基因玉米MON863品系特异定量PCR方法的建立

根据转基因玉米MON863外源基因的旁侧序列,设计引物和TaqMan探针,建立了转基因玉米MON863品系特异定量PCR检测方法,并采用该法检测了1%含量的MON863玉米粉末(不确定度为10%)。结果显示,采用构建的方法获得的标准曲线斜率为-3.6～-3.1,相关系数大于0.99,扩增效率为102.2%,在90%～110%内。样品的定量检测结果1.113%接近已知含量1%(不确定度为10%),表明建立的转基因玉米MON863品系特异定量PCR检测方法的灵敏度和准确度高,可以在日常检验中推广应用。