添加植物油降低饲粮n-6/n-3多不饱和脂肪酸比值对生长肥育猪脂肪沉积和脂肪酸组成及脂代谢相关基因表达的影响

本试验旨在研究饲粮添加植物油降低n-6/n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)比值对生长肥育猪脂肪沉积和脂肪酸组成及脂代谢相关基因表达的影响。试验选用54头体重[(45.30±1.72)kg]相近的“杜×长×大”三元杂交猪,随机分为3组,每组6个重复,每个重复3头。对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂含4.5%菜籽油(菜籽油组)和4.5%混合油(混合油组,菜籽油∶亚麻籽油=1∶1)的饲粮。3组饲粮粗脂肪含量分别为2.76%、7.24%和7.24%,n-6/n-3 PUFA比值分别约为10∶1、4∶1和2∶1,消化能和粗蛋白质含量基本相同。预试期7 d,正试期42 d。结果表明:1)与对照组相比,饲粮添加植物油显著提高生长肥育猪背最长肌肌内脂肪(IMF)含量(P<0.05),对平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)及背膘厚无显著影响(P>0.05)。2)与对照组相比,饲粮添加植物油显著提高背最长肌和皮下脂肪n-3及总PUFA含量(P<0.05),降低n-6/n-3 PUFA比值(P<0.05);与菜籽油组相比,混合油组背最长肌和皮下脂肪n-3 PUFA含量显著提高(P<0.05),n-6/n-3 PUFA比值显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,饲粮添加植物油显著提高背最长肌和皮下脂肪组织脂肪酸转位酶/CD36(FAT/CD36)和脂肪酸转运蛋白1(FATP1)mRNA相对表达量(P<0.05),且混合油组背最长肌FAT/CD36和脂肪酸转运蛋白4(FATP4)mRNA相对表达量显著高于菜籽油组(P<0.05)。4)与对照组相比,饲粮添加植物油显著提高背最长肌碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)、葡萄糖转运子4(Glut4)及脂肪酸合酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸延伸酶5(Elovl5)和脂肪酸延伸酶6(Elovl6)等生脂基因mRNA相对表达量(P<0.05),显著降低皮下脂肪组织过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、维甲酸X受体α(RXRα)及生脂基因mRNA相对表达量(P<0.05)。综上所述,添加植物油降低饲粮n-6/n-3 PUFA比值可上调FAT/CD36和FATP1表达,促进猪肌肉和皮下脂肪组织吸收和利用饲粮长链脂肪酸合成脂肪;下调PPARγ及生脂基因表达,抑制皮下脂肪组织从头脂肪合成,而上调ChREBP及生脂基因表达,促进背最长肌脂肪合成,提高IMF含量,且饲粮n-6/n-3 PUFA比值为2∶1时能更有效地改善组织n-3 PUFA含量和n-6/n-3 PUFA比值。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

γ－亚麻酸（ＧＬＡ，Ｃ１８：３△６，９，１２）是由△６－脂肪酸脱氢酶以亚油酸（ＬＡ，Ｃ１８：２△９，１２）为底物，在Ｃ６位脱氢形成的。由于在人体中，γ－亚麻酸是花生四烯酸、前列腺素类和白三烯类等生理活性物质的前体物，而深黄被孢霉是目前用于微生物发酵生产γ－亚麻酸的主要菌株。本文根据脂肪酸脱氢酶的保守区设计引物，利用反转录聚合酶链式反应从丝状真菌深黄被孢霉中克隆了编码△６－脂肪酸脱氢酶的ｃＤＮＡ，全长为１３７４个核苷酸，编码４５７ 个氨基酸，但与其他位点的脂肪酸脱氢酶不同的是， △６－脂肪酸脱氢酶在其序列的 Ｎ 端特有细胞色素 ｂ５（Ｃｙｔｂ５）区。这是国际上对深黄被孢霉△６－脂肪酸脱氢酶基因的首次报道。

深黄被孢霉M_(6-22) Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

应用PCR技术 ,从含有深黄被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pTMICL6中 ,扩增出 1 38kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMID6,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择到酵母工程株YMID6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株所含的全部脂肪酸进行色谱分析 ,结果表明 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 8 69%。

高山被孢霉ATCC16266Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

Δ6 脂肪酸脱氢酶是形成γ 亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT MACL6中 ,酶切出 1 4kb的目的片段 ,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体 pYES2 .0 ,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒 pYMAD6 ,用醋酸锂方法转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INCSc1中 ,在SC Ura合成培养基中 ,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下 ,加入外源底物亚油酸 ,经半乳糖诱导后 ,收集菌体。通过GC MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了 31 6 %的γ 亚麻酸。这是迄今为止 ,国内外Δ6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

为在传统的油料作物大豆中产生γ 亚麻酸 ,从深黄被孢霉中克隆的Δ6 脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI12 1连接 ,构建了重组质粒pBMICL6 ,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将该基因导入到栽培大豆吉林 35、吉林 4 3、吉林 4 7、绥农 10、绥农 14和黑农 37等品种中 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。对转基因大豆种子进行脂肪酸成分分析 ,结果表明Δ6 脂肪酸脱氢酶基因获得表达 ,产生了γ 亚麻酸 ,其含量最高可达 2 7 0 6 7% ,这是国内外深黄被孢霉Δ6

少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

【目的】验证少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况,为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础。【方法】将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接,构建重组表达质粒pCPNRAD6,采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法,将该基因导入甘蓝型油菜H165,获得转基因植株,最后通过气相色谱检测基因的表达情况。【结果】PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明,目的基因已经整合到油菜基因组中,Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达,气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,证明目的基因获得功能表达。同样,用改变少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有提高。【结论】初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系。

高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、结构分析及其功能的研究

从高山被孢霉ATCC1 62 66总DNA中扩增出大小为 1 374bp和 1 947bp的两条特异片段 ,序列分析表明后者在细胞色素b5和组氨酸Ⅰ之间含有一大小为 5 73bp的内含子和两条分别为 1 97bp和 82 8bp的外显子。推导的氨基酸二级结构分析表明 ,该基因有两个长的跨膜疏水区和 3个组氨酸保守区。分别根据D6D内含子及组氨酸Ⅱ区、Ⅲ区的序列设计引物 ,制备不同的探针与高山被孢霉的基因组杂交 ,证明在其基因组中确实存在两个Δ6 脂肪酸脱氢酶基因 ,其中一个基因含有内含子。把不含有内含子的核基因MAGL6 1克隆到的酿酒酵母表达载体pYES2 0中 ,转化到酿酒酵母INVSc1中。对筛选得到的酵母工程菌株进行脂肪酸GC分析 ,检测到了γ 亚麻酸 ,说明克隆的D6D基因MAGL6 1能在酿酒酵母中进行功能性表达。

深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因导入大豆

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将深黄被孢霉△6 -脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽 5 - 7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 5 0mg L卡那霉素的选择培养基上培养 2 - 4w后 ,从子叶节处诱导出抗性不定芽。将不定芽转移到伸长培养基上 ,4 - 6w后长至 2 - 3cm高的再生苗。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2 - 6w生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入花盆中 ,部分移栽成活的T0 植株能正常开花结荚。从T0 植株上收获T1 种子 ,按株系种植。T0 和T1 代经PCR检测和DNA分子杂交分析 。

少根根霉Δ_-~6脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达(英文)

Δ6- 脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ6- 脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ6- 脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α- 亚麻酸在Δ6和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的功能。

向大豆导入深黄被孢霉△^6—脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

通过农杆菌介导法 ,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉育 4 3、黑农36、黑农 37等品种。采用多种外植体和感染方法 ,从子叶节和胚轴诱导出丛生芽与再生植株。经过在含 5 0mg L卡那霉素的筛选培养基中连续筛选 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析 ,初步证明外源基因已导入并整合到大豆基因组中。

转基因烟草表达高山被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的研究

将高山被孢霉ATCC16 2 6 6Δ6 脂肪酸脱氢酶 (D6D)基因亚克隆到植物表达载体pBI12 1中 ,构建了CaMV35S启动子驱动的植物表达载体pBMACL6。经根癌农杆菌LBA4 4 0 4的介导 ,采用叶盘法转化烟草Xanthi,得到一批转基因烟草植株。转基因植株的PCR和Southernblot分析表明 ,D6D基因已经整合到烟草基因组中。脂肪酸GC分析表明 ,与未转基因的烟草苗对照相比 ,转基因植株有D6D基因目标产物γ 亚麻酸的产生 ,说明高山被孢霉的D6D基因在烟草中得到了表达。

Δ~6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α 亚麻酸作为底物 ,经半乳糖诱导 ,在含有少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成 ;同时添加亚油酸和α 亚麻酸时 ,检测到γ 亚麻酸和十八碳四烯酸生成 ,而且十八碳四烯酸的含量是γ 亚麻酸含量的 3 81倍 ,表明在酿酒酵母中少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶不仅能催化α 亚麻酸生成十八碳四烯酸 ,而且偏好n 3途径中的底物α 亚麻酸。同样 ,在改变少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母中 ,也得到类似的结果 。

军曹鱼△6脂肪酸去饱和酶的cDNA序列克隆与基因表达

为了研究海水鱼合成高度不饱和脂肪酸(Highly unsaturated fatty acids,HUFAs)的关键酶,本研究克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)的△6脂肪酸去饱和酶的部分cDNA序列。根据GenBank已公布的其他鱼类的△6脂肪酸去饱和酶cDNA序列进行分析,设计了一对用于PCR扩增军曹鱼的△6脂肪酸去饱和酶基因保守序列的引物;然后以军曹鱼肝总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出一段长度为743bp的片段,该片段经纯化后,连接至pMD18-T载体上进行测序。结果显示,该片段与欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)△6脂肪酸去饱和酶基因的覆盖区同源性为90.4%,该蛋白结构含有2个组氨酸保守区(HDFGH和HFQHH)和2个跨膜结构域,具有典型的△6脂肪酸去饱和酶结构特点。通过荧光定量PCR(Real-time quantityPCR,RTQ-PCR)检测该基因在军曹鱼幼鱼不同组织中的表达量,发现△6脂肪酸去饱和酶基因在军曹鱼脑的表达量最高;其次是肝;再其次是心、肠、脾、肾、鳃;而肌肉和皮肤的表达量相对较低,在脂肪组织中没有检测到△6去饱和酶基因的表达。结论为,军曹鱼具有合成HUFAs的关键酶—△6脂肪酸去饱和酶,在其所有组织中以脑之含量最多。

农杆菌介导法将深黄被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)导入油菜的研究

△6-脂肪酸脱氢酶基因可将亚油酸转化为γ-亚麻酸。我们将克隆的深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)插入植物表达载体pBI121,构建了重组质粒pBI121-D6DMI。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导途径,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入了甘蓝型油菜恢复系,经过诱导分化获得抗卡那霉素的再生植株。PCR检测及Souther杂交结果表明,外源基因△6-脂肪酸脱氢酶基因已整合到油菜再生植株的基因组中。

n-6/n-3多不饱和脂肪酸不同比例对乳腺癌细胞脂代谢调控基因的影响

目的探讨不同n-6/n-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid,PUFA）构成对乳腺癌细胞脂代谢调控基因及MAPK活性的影响.方法选用MCF-7（ER＋）和MDA-MB-231（ER-）乳腺癌细胞为实验对象,用不同n-6/n-3 PUFA构成（1～10）处理细胞后,MTT法观察细胞增殖能力,RT-PCR分析细胞脂代谢关键性调控基因（COX-2、5-LOX、PPARβ和PPARγ）表达变化,Western blot检测细胞MAPK蛋白磷酸化水平.结果 MCF-7细胞不表达COX-2基因.与对照组相比,单纯n-6和10：1 n-6/n-3 PUFA能明显促进这两种乳腺癌细胞增殖,诱导细胞COX-2、5-LOX、PPARβ和PPARγmRNA表达上调,并促进细胞MAPK磷酸化（P＜0.01）;与之相反的是,单纯n-3和1：1 n-6/n-3 PUFA显著抑制细胞生长,下调细胞COX-2、5-LOX、PPARβ和PPARγ mRNA表达,并抑制细胞MAPK磷酸化（P＜0.01）;但5：1 n-6/n-3 PUFA效果不明显.结论 n-6/n-3 PUFA不同比例对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞脂代谢调控基因及信号转导的影响是不同的.在n-6/n-3比值为1～10范围内,单纯n-3和1：1 n-6/n-3能明显抑制脂代谢基因表达及信号转导,发挥显著抗乳腺癌细胞增殖效应.

匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)As3.38△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆与酵母表达

通过气相色谱法(GC)快速分析8种真菌的脂肪酸成分,发现匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)具有较高的γ-亚麻酸含量,利用RT-PCR和RACE方法获得了全长为1475bp的匍枝根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的cDNA序列,其中开放阅读框为1380bp,编码459个氨基酸。生物信息学分析所克隆的基因具有△6-脂肪酸脱氢酶的典型结构:N端具有细胞色素b5结构、具有3个保守的组氨酸区序列和跨膜结构;把该基因的开放阅读框序列连接到表达载体pYES2.0上,构建重组表达载体pYRnD6D,并将其转入缺陷型酿酒酵母INVScl中进行表达。GC分析表明,该序列在酵母中获得了表达,表达产物表现出△6-脂肪酸脱氢酶的酶学活性,能将底物亚油酸转化为γ-亚麻酸。新生成的γ-亚麻酸占酵母细胞总脂肪酸的12.25%。

深黄被孢霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因敲除及鉴定

以产油丝状真菌深黄被孢霉M6—22（Mortierella isabellina 6-22）为出发菌株，利用亚硝基胍诱变技术筛选到一株对潮霉素药物敏感的菌株Mortierella isabellina 6-22—4，同时构建了含有潮霉素抗性基因表达单元和深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因5’与3’端部分同源序列的重组质粒PD4M16，用于对深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的敲除.通过PEG／CaCl2介导的原生质体转化法，将质粒PD4M16转化入深黄被孢霉M6—22—4菌株．转化子经潮霉素抗性选择平板筛选、分子检测获得了一个△^6-脂肪酸脱氢酶基因缺失的突变株Mut6．气相色谱分析结果显示，该突变株γ-亚麻酸特征峰消失，相应地亚油酸产量显著增加．培养结果表明该突变株的菌落形态、颜色及生长状况与出发菌株M6—22或M6—22—4相比均有显著改变。

高山被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因转化大豆的研究

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将高山被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入到栽培大豆吉林 4 3和黑农37品种中。经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 5 0mg/L卡那霉素的选择培养基上连续筛选 ,获得一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析 ,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。通过GC -MS对大豆种子进行脂肪酸色谱分析 ,结果表明 ,产生了γ -亚麻酸 ,其含量最高可达 18.2 3%。

酿酒酵母中少根根霉△~6-脂肪酸脱氢酶对α-亚麻酸催化活性的研究

多不饱和脂肪酸(po lyunsaturated fatty ac ids,PU FA s)可分为n-6和n-3两个系列,而Δ6-脂肪酸脱氢酶是这些PU FA s合成途径中的限速酶.将少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因转化酿酒酵母营养缺陷型菌株INV S-cl,在添加外源性底物α-亚麻酸,经半乳糖诱导后,通过气相色谱(GC)和气相色谱/质谱(GC-M S)联用分析细胞脂肪酸表明,少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,所生成十八碳四烯酸的含量占酵母细胞总脂肪酸的7.67%,而在空载体pYES2.0转化的酵母中没有检测到.同时,参照K ozak序列,我们把少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列进行适当的改变,并转化INV Scl进行分析,结果显示修改后的序列同样能催化α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸,而且表达量提高到细胞总脂肪酸的11.23%,表明在酿酒酵母中,改变转移起始密码子周边序列可提高少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因催化α-亚麻酸转合成十八碳四烯酸的水平.

根癌农杆菌介导深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因转化大豆及其转基因植株再生

采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功的将深黄被孢霉△6 脂肪酸脱氢酶基因导入大豆。从发芽 5～ 7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体 ,经农杆菌浸染和共培养后 ,在含 50mg L卡那霉素的选择培养基上培养 2～ 4周后 ,从子叶节处诱导出抗性不定芽。将不定芽转移到伸长培养基上 ,4～ 6周后长至 2～ 3cm高的再生苗。再将再生苗切下转入生根培养基 ,2～ 6周生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入花盆中 ,部分移栽成活的T0 植株能正常开花结荚。从T0 植株上收获T1种子 ,按株系种植。T0 和T1代经PCR检测和DNA分子杂交分析 。