知母中知母皂苷BⅡ含量测定方法的研究

目的:建立HPLC-ELSD法检测知母中知母皂苷BⅡ的含量测定方法。方法:采用Agilent TC-C18(4.6×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(24∶76);漂移管温度为105℃,载气流速为3.0 L/min。结果:知母皂苷BⅡ进样量在0.7850～19.625μg范围内呈良好线性关系,平均回收率为103.1%(n=6,RSD=1.04%)。结论:该方法准确可靠,无干扰,可用于知母药材的质量控制。

知母皂苷B-Ⅱ在比格犬体内的药代动力学研究

目的建立比格犬血浆中知母皂苷B-Ⅱ的LC-MS/MS测定方法,并应用于知母皂苷B-Ⅱ的药代动力学研究。方法液相色谱分离采用ODS柱(150 mm×2.1 mm,5μm),以乙腈-0.05%甲酸溶液(35∶65)为流动相,质谱检测采用ESI离子源,MRM负离子模式。将6只比格犬随机分成2组,单剂量交叉静注或口服知母皂苷B-Ⅱ,剂量分别为2,30 mg.kg-1,定时采集血样,测定比格犬体内的血药浓度,并计算药代动力学参数。结果比格犬静注和口服知母皂苷B-Ⅱ后的主要药代动力学参数如下:Cmax分别为(21507±7307)、(313±149)ng.mL-1;AUC0-t分别为(19177±5692)、(1879±738)ng.h.mL-1;AUC0-∞分别为(19770±5879)、(2153±695)ng.h.mL-1;t1/2分别为(7.81±2.61)、(6.01±5.28)h;MRT0-t分别为(2.89±0.39)、(6.27±1.80)h;MRT0-∞分别为(3.88±0.39)、(8.59±3.18)h。结论该法可用于比格犬血浆中知母皂苷B-Ⅱ的检测及其体内药代动力学研究,比格犬口服知母皂苷B-Ⅱ后的绝对生物利用度为(0.72±0.29)%。

知母皂苷B⁃Ⅱ抑制秀丽隐杆线虫Aβ蛋白毒性作用及机制研究

目的探究知母皂苷B⁃Ⅱ(timosaponin B⁃Ⅱ,TSB⁃Ⅱ)对秀丽隐杆线虫体内β淀粉样蛋白(β⁃amyloid,Aβ)沉积的作用及可能机制。方法以转基因线虫CL4176为模型,考察TSB⁃Ⅱ对线虫瘫痪、寿命、氧化应激和热应激、活性氧水平、Aβ体外聚集等实验的影响,蛋白点印记分析观察药物对线虫体内Aβ聚集情况的影响以及用qRT⁃PCR检测线虫体内与AD相关基因的表达。结果TSB⁃Ⅱ不同浓度给药组均能抗线虫瘫痪、延长线虫寿命、降低活性氧、减轻氧化损伤及热应激损伤和降低Aβ聚集(P<0.05)。蛋白印迹分析显示,TSB⁃Ⅱ不同浓度组均能降低线虫体内Aβ的聚集和沉积(P<0.01)。qRT⁃PCR结果显示,TSB⁃Ⅱ给药组相比较模型组可上调sod⁃3、hsp⁃16.2、daf⁃16 mRNA表达,下调skn⁃1和amy⁃1 mRNA表达(P<0.05)。结论TSB⁃Ⅱ具有抑制Aβ的聚集作用,其作用机制可能与寿命胰岛素信号通路相关,也与小热休克蛋白hsp⁃16.2的上调表达有关。

知母的盐制工艺优化

目的:优化知母的盐制工艺。方法:以知母皂苷BII和芒果苷的含量为考察指标,盐用量、焖制时间、炒制温度、炒制时间为考察因素,采用正交试验法优化知母的盐制工艺。结果:设定盐知母中知母皂苷BII和芒果苷的权重比为1∶1时,盐用量2.0%,焖制时间1.0 h,炒制温度180℃,炒制时间12 min为知母的最佳盐制工艺。结论:该实验优化的知母盐制工艺切实可行,可为规模化生产提供数据参考。

知母常用炮制工艺的比较研究

目的比较知母不同炮制工艺有效成分的含量,确定最佳的炮制工艺。方法采用HPLC-DAD法测定不同产地知母中新芒果苷和芒果苷的含量,HPLC-ELSD法测定知母皂苷BⅡ的含量,并比较不同炮制品有效成分的含量。结果知母经炮制后,新芒果和知母皂苷BⅡ的含量有不同程度的降低,而芒果苷的含量有一定程度的增加,总体而言,三种成分含量的大小顺序为:知母片>微波炮制品>酒炙知母>盐炙知母>麸炒知母>清炒知母。结论知母微波炮制法具一定的科学性,可作为知母新的炮制工艺。

知母皂苷BII在模拟人体胃肠道环境及生物样品中的稳定性研究

目的考察知母皂苷BⅡ在不同生理p H介质和生物样品中的体外稳定性。方法取知母皂苷BⅡ分别在不同生理p H介质(p H 1.2,6.8,7.4,8.0)的缓冲液、人工胃液、无蛋白酶人工胃液、人工肠液、无蛋白酶人工肠液介质和离体生物介质中进行孵育,利用HPLC测定不同介质中知母皂苷BⅡ的含量变化,考察知母皂苷BⅡ的降解情况及酶稳定性。结果知母皂苷BⅡ在不同生理p H介质溶液中9 h内未发生明显降解,在离体大鼠大肠和小肠及其内容物中发生明显降解。结论知母皂苷BⅡ在模拟人体胃肠道环境的溶液中很稳定,不会发生明显降解,在大鼠大肠及其内容物和小肠及其内容物中发生明显降解,不受胃蛋白酶和胰蛋白酶的影响,受肠道菌群作用的影响。

知母皂苷BⅡ对大鼠神经干细胞向酪氨酸羟化酶阳性神经元分化的影响

目的探讨知母皂苷BII ( timosaponin B-II,TB-II)对大鼠来源的神经干细胞( neural stem cells,NSCs)向酪氨酸羟化酶阳性(tyrosine Hydroxylase,TH)神经元分化的影响.方法原代培养大鼠神经干细胞,采用细胞增殖计数法、形态学观察和免疫组化等方法鉴定NSCs的自我增殖能力和多向分化的生物学功能.取第三代( P3) NSCs,设立无添加 TB-II的血清自然分化组为对照组, TB-II实验组依次添加10 μg/ml、30 μg/ml和100 μg/ml ,作用7 d.采用免疫组织化学方法检测TH在各组的表达情况;Western blot法检测分化细胞TH蛋白表达的程度.结果(1)所培养细胞具备自我增殖能力,表达nestin蛋白,分化为神经元和神经胶质细胞,符合神经干细胞生物学属性.(2)与对照组相比,TB-II 30 μg/ml剂量组和TB-II 100 μg/ml剂量组 TH阳性细胞比率均升高[( 10. 03 ± 1. 36)%,(20. 01±3. 37)%,(31. 32±3. 98)%],差异有统计学意义(t=16. 54,6. 15,均P<0. 05). TB-II 10 μg/ml组与对照组比较差异无统计学意义(t=18. 36,P>0. 05).(3)Western结果显示,与对照组比较,TB-II 30 μg/ml剂量组和TB-II 100 μg/ml组的TH蛋白的相对表达量升高,差异有统计学意义[对照组:( 1. 02 ± 0. 24),TB-II 30 μg/ml 剂量组:( 3. 64 ± 1. 78),TB-II 100 μg/ml 剂量组:( 5. 88 ± 2. 34);t=12. 58,9. 15,均P<0. 05]. TB-II 10 μg/ml组与对照组比较差异无统计学意义( t=16. 42,P>0. 05).结论 TB-II可促进NSCs向TH阳性神经元分化.

二母颗粒中知母水提工艺优化

目的:优选二母颗粒中知母的水提工艺。方法:以HPLC测定知母皂苷BⅡ、芒果苷的含量及干膏收率为指标进行综合评价,采用正交试验法,考察溶媒用量、浸润时间、提取时间及提取次数等水提工艺参数。结果:提取次数对水提工艺有显著性影响,确定较佳提取工艺为A1B1C1D3,即知母饮片加6倍量水,不浸泡,提取3次,每次30 min。结论:该优选水提工艺稳定、合理可行。

四味退热丸质量标准的研究

目的建立四味退热丸的质量控制方法。方法采用显微鉴别法鉴别处方中知母、石膏、白薇;用TLC鉴别处方中知母;并用HPLC测定成品中芒果苷的含量。结果在显微鉴别中能检出知母、石膏、白薇;在薄层色谱中能检出知母;芒果苷在0.102 1~2.042μg范围内与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 9）,平均加样回收率为96.7%,RSD为0.69%（n=6）。结论该方法简便、准确、可靠,可有效控制四味退热丸的质量。