人心房成纤维细胞体外组织块贴壁培养与鉴定

从建立体外循环将进行心脏手术的风湿性心脏病患者体内无菌下取心脏停跳前右心耳组织,采用组织块贴壁法进行心房成纤维细胞的分离培养,通过光学显微镜观察培养后的细胞形态,并通过免疫细胞化学的方法鉴定所分离培养的细胞。贴壁4—6d后可见长梭形贴壁生长的细胞游离出组织块,细胞生长迅速,2—3d后即呈融合状态,细胞排列紧密,有的交叉重叠生长,胞体较大,细胞浆透明,细胞核较大,呈椭圆形,无自发性搏动。免疫细胞化学检测显示所培养细胞波形蛋白呈阳性反应。通过组织块贴壁法顺利分离人心房成纤维细胞。

新生大鼠下颌骨成骨细胞的分离、培养与鉴定

目的探求高效、经济、方便的新生大鼠下颌骨成骨细胞的原代培养方法,为研究下颌骨成骨细胞的相关特性奠定基础。方法无菌条件下取新生24h大鼠的下颌骨,采用组织块贴壁法培养成骨细胞,通过细胞形态学观察、碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP)、茜素红染色对细胞进行鉴定,并与颅骨分离的成骨细胞进行对比。结果所分离培养的细胞通过倒置相差显微镜观察呈梭型,碱性磷酸酶染色阳性,能形成钙结节,与颅骨分离的成骨细胞有相似的形态和相同的功能。结论采用组织块贴壁法成功分离出大量纯化的新生大鼠下颌骨成骨细胞,为体外研究下颌骨成骨细胞的特性奠定了实验基础。

树鼩成纤维样滑膜细胞分离鉴定及TLR8通路相关分子检测方法的建立

背景:成纤维样滑膜细胞在类风湿关节炎病变过程中发挥着重要的作用,当炎症性关节炎发生时滑膜衬里层成纤维样滑膜细胞会大量增殖,释放炎症因子能引起关节炎症和软骨的损伤。目的:建立树鼩膝关节成纤维样滑膜细胞体外分离、培养纯化及鉴定的方法,并探讨其生物学特性;建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子的检测方法,初探TLR8通路在细胞中的活化情况。方法:利用组织块贴壁法和连续传代法分离、纯化树鼩成纤维样滑膜细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,苏木精-伊红染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色法检测成纤维样滑膜细胞的标志性蛋白(波形蛋白)的表达。经人TLR8配体R848刺激前后,采用Western blot方法检测树鼩成纤维样滑膜细胞与人成纤维样滑膜细胞中TLR8及其信号通路蛋白的表达,采用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测树鼩成纤维样滑膜细胞中TLR8通路及其下游基因mRNA的表达。结果与结论:①倒置显微镜下可见,经过3代的传代培养后,树鼩成纤维样滑膜细胞多为梭形,大小相近,纯度高,在体外生长增殖状况良好;苏木精-伊红染色显示细胞形态多呈梭形,大小相近;免疫细胞化学染色显示,成纤维样滑膜细胞胞浆波形蛋白表达阳性;CCK-8实验结果显示,树鼩成纤维样滑膜细胞生长曲线为“S”型;②Western blot检测显示,经R848刺激48 h后,树鼩成纤维样滑膜细胞中的核因子κB蛋白表达升高(P<0.05),p-P38蛋白表达降低(P<0.05),TLR8、MyD88、P38、p-Erk1/2、和RANKL蛋白表达无明显变化(P>0.05);人成纤维样滑膜细胞中的p-P38蛋白表达降低(P<0.05),TLR7、TLR8、MyD88、核因子kB、P38、p-Erk1/2和RANKL蛋白表达无明显变化(P>0.05);③RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测显示,经R848刺激48 h后,树鼩成纤维样滑膜细胞中肿瘤坏死因子ɑ、白细胞介素6、干扰素β、TLR9-2、TLR9-1、TLR8-2、TLR8-1、TLR7-2、TLR7-1 mRNA表达无明显变化(P>0.05);④结果表明,采用组织贴壁法可分离树鼩成纤维样滑膜细胞,利用人来源抗体可建立树鼩成纤维样滑膜细胞TLR8通路相关分子检测方法。

树鼩原代耳缘成纤维细胞体外分离培养及鉴定的研究

目的:旨在建立树鼩耳缘成纤维细胞体外分离、培养纯化及鉴定的方法。方法:采用组织块贴壁法进行原代树鼩耳缘成纤维细胞(TSEF)的分离培养,将获得的细胞利用波形蛋白(Vimentin)进行免疫荧光鉴定,RT-qPCR法检测Vimentin基因mRNA的相对表达量;用苏木精—伊红(HE)染色,观察细胞形态;用细胞增殖试剂盒(CCK-8)检测TSEF的增殖情况;利用流式细胞仪检测第3代和第5代细胞周期和凋亡的情况。结果:通过组织块贴壁法可以成功分离出树鼩的耳缘成纤维细胞,在倒置荧光显微镜下原代细胞呈现出长梭形、多触角、鱼群状等形态;细胞免疫荧光Vimentin呈现强阳性;TSEFVimentin mRNA的相对表达量与小鼠3T3 Swiss albino细胞Vimentin mRNA的相对表达量无明显差异(P>0.05)。HE染色结果显示,该细胞形态呈典型的长梭形或星形,细胞质染为淡紫色,细胞核着深紫色,为规则的卵圆形;检测原代细胞增殖情况,细胞增殖曲线呈典型的S形,且第2至第3天是细胞的最佳增殖期。第3代和第5代细胞在G0/G1期所占的比例没有明显地改变(P>0.05),且处于G0/G1期的细胞占主导地位;两代细胞的凋亡率较低且没有明显变化(P>0.05)。结论:组织块贴壁法可成功提取TSEF,且细胞在第3至第5代内生长状况良好,可用于体细胞核移植等科学研究活动。